On DNA-conjugated antibodies for protein detection and protein-interaction analysis

Medientyp: E-Book

Titel: On DNA-conjugated antibodies for protein detection and protein-interaction analysis

Beteiligte: Wiener, Julius [Verfasser]; Meier, Matthias [Akademischer Betreuer]

Körperschaft: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Angewandte Wissenschaften

Erschienen: Freiburg: Universität, 2021

Umfang: Online-Ressource

Sprache: Englisch

DOI: 10.6094/UNIFR/217968

Identifikator:

Schlagwörter: Immunoglobulins ; Bar coding ; DNA Barcoding ; Antikörper ; Konjugate ; Proteine ; (local)doctoralThesis

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, Universität Freiburg, 2021

Anmerkungen:

Beschreibung: Abstract: Als fundamentale Bausteine jedes Organismus stellen Proteine seit langem eines der wichtigsten Studienobjekte in der Biologie dar. Je nach Kontext und Anforderung der Analyse stehen Wissenschaftlern eine Reihe von Methoden zur Verfügung. Während die Immunofluoreszenz eine Lokalisation einzelner Proteine \textit{in situ} erlaubt, ermöglichen die Co-Immunopräzipitation oder die Oberflächen-Plasmonenre- sonanz eine genauere Quantifizierung der Proteine, sowie deren Interaktionen mit anderen Proteinen. Die PLA-Methode (\textit{proximity ligation assay}) vereinigt beide dieser Vorzüge indem sie durch die Bildung fluoreszenter DNA-Punkte innerhalb der Zelle eine \textit{in situ} Quantifizierung einzelner Proteine sowie von Protein-Interaktionen möglich macht. \\ In Kapitel 3.1.1 (\textit{The Bat Influenza Entry Path into the Human Cell}) werden die Möglichkeiten der PLA anhand des kürzlich entdeckten Fledermaus-Influenzavirus H18N11 demonstriert: Die Interaktion zwischen dem menschlichen Zelloberflächenprotein HLA-DR und dem Fledermaus-Haemagglutinin H18 können erfolgreich gezeigt werden. Dies legt nahe, dass H18N11 über die Interaktion mit HLA-DR auch menschliche Zellen infizieren kann. Im Rahmen des Projekts wird auch die Möglichkeit einer KI-basierten PLA-Bildauswertung untersucht. Verschiedene Klassifizierungsmethoden werden dabei miteinander, sowie mit der klassischen algorithmischen Auswertung verglichen. Hierbei zeigt sich, dass zwar die KI-basierte Auswertung schwache und gruppierte PLA-Punkte besser erkennt, sie jedoch deutlich mehr Zeit benötigt als der algorithmische Ansatz. Weitere Optimierungen sind nötig um die KI-basierte Auswertung in dieser Hinsicht kompetetiv zu machen. \\ Das Projekt \textit{Interactions Of The Insulin Inhibitory Receptor} in Kapitel 3.1.2 wendet die PLA-Methode zur Identifizierung von Interaktionspartnern des neuentdeckten Rezeptors Inceptor an. Die Studie zeigt, dass das Protein mit sich selbst (Homodimerisierung) und mit IRS2 interagiert und ein Heterodimer mit dem Insulinrezeptor bildet. Dieses Heterodimer findet sich überwiegend in räumlicher Nähe zum endoplasmatischen Retikulum. Die Beobachtung legt nahe, dass Inceptor ein Internalisierungssignal für den Insulinrezeptor darstellt, welches zum Abbau und dadurch zur Desensibiliserung der Zelle für Insulin führt. Darüberhinaus zeigt die Studie wie die PLA-Methode auch zur Untersuchung von Protein- und Protein-Interaktionsdynamiken genutzt werden kann. Eine Zeitreihe mit Insulin- und Glukose-Stimulationen zeigt Verschiebungen der PLA-Punkte verschiedener Interaktionen innerhalb der Zelle und erlaubt dadurch Einblicke in die Internalisierungsmechanismen von Inceptor.\\ In Kapitel 3.1.3 (\textit{Blocking-PLA}) wird das Funktionsprinzip der PLA dazu genutzt um submolekulare Informationen über Interaktionen im Rahmen einer Epitopkartierung zu gewinnen: Das Homodimer von Inceptor wird mit jeweils einem von zwölf verschiedenen monoklonalen Antikörpern inkubiert und analysiert. Ein reduziertes PLA-Signal indiziert anschließend eine Blockade der Interaktionsdomäne. Drei Antikörper werden gefunden, die das Signal um mehr als 40\% reduzieren. Diese Antikörper können in zukünftigen Experimenten potenziell dazu verwendet werden die Internalisierung des Insulinrezeptors zu beeinflussen. \\ Kapitel 3.1.4 (Cite-Seq) wendet das zugrundeliegende Prinzip der PLA - den DNA-konjugierten Antikörper - an, um mit der Cite-Seq-Methode Proteine in Einzelzellen zu identifizerien. Die Methode basiert auf der Einzelzell-RNA Sequenzierung, bei der innerhalb eines Tröpfchen-Mikrofluidik-Aufbaus die Nukleinsäuren von Einzelzellen an Mikrokugeln abgegeben werden, welche die Weiterverarbeitung der Nukleinsäuren und die Vorbereitung einer DNA-Sequenzierung ermöglichen. Indem Proteine mit speziellen, bekannten DNA-Strängen versehen werden eröffnet sich diese Nukleinsäure-basierte Methode auch für die Welt der Proteomik. Das Projekt demonstriert, wie 20 Proteine gleichzeitig erfolgreich in einzelnen Zellen quantifiziert werden können. Bioinformatische Methoden werden anschließend verwendet um Rückschlüsse auf die Zellidentität einzelner Zellen innerhalb einer großen Population zu ziehen. \\ Die Konjugation von Proteinen mit DNA bildet die Voraussetzung für die Durchführung von PLA, Cite-Seq und weiteren Methoden. Zur Sicherung hochwertiger Ergebnisse und Senkung der Experimentkosten ist eine effiziente Konjugation daher unabdinglich. In Kapitel 3.2.1 \textit{Improving DNA Antibody Conjugation} wird eine verbesserte Methode der Konjugation entwickelt. Auf Grundlage einer optimerten SPAAC-Chemie (\textit{Strain Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition}) werden Protein und DNA-Strang verbunden und zur Aufreinigung und Qualitätskontrolle durch eine Anionenaustausch-Chromatographiesäule filtriert. Dabei werden ausschließlich Einzelkonjugate (bestehend aus einem DNA-Molekül und einem Protein-Molekül) aufgefangen. Die Effizienz der Methode wird anschließend durch PLA-Experimente bestätigt. \\ Die Cite-Seq-Methode wird in Kapitel 3.2.2 um die Möglichkeit erweitert, Interaktionen in Einzelzellen zu detektieren. Dabei wird ein Prinzip der PLA - \textit{die rolling circle amplification (RCA)} - verwendet um das Signal zu vervielfältigen. Die Studie zeigt, dass das entwickelte Prinzip funktioniert. Eine Steigerung der Effizienz gilt es jedoch mit zukünftigen Experimenten zu erreichen

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