Entwicklung eines Routineverfahrens zur durchflusszytometrischen Differenzierung somatischer Zellen in Rohmilch

Media type: E-Book; Thesis

Title: Entwicklung eines Routineverfahrens zur durchflusszytometrischen Differenzierung somatischer Zellen in Rohmilch

Contributor: Bunge, Anne [VerfasserIn]; Krömker, Volker [AkademischeR BetreuerIn]

imprint: Hannover, 2017

Extent: 1 Online-Ressource (84 Seiten, 1.206 KB)

Language: German

Identifier:

Keywords: Prognoseentscheidung > Zelldifferenzierung > Somazelle > Rohmilch > Euterentzündung

Origination:

University thesis: Dissertation, Tierärztliche Hochschule Hannover, 2017

Footnote: Zusammenfassungen in deutscher und englischer Sprache

Description: Um den Antibiotikaeinsatz in der Mastitistherapie nachhaltig zu reduzieren, wird eine individuelle Bewertung der Therapiewürdigkeit jeder klinischen Mastitis empfohlen. Anhand kuh-individueller Kennzahlen aus den Daten der Milchleistungsprüfung wird derzeit eingeschätzt, ob eine antibiotische Behandlung die Heilung der Milchdrüse signifikant steigern kann oder ob eine ausschließlich antiphlogistische Therapie das Mittel der Wahl ist. Um Tiere mit einer geringen Heilungschance identifizieren zu können, soll eine Differenzierung der somatischen Zellen im Gesamtgemelk dienen. Ziel der ersten Studie war es, die Zelldifferenzierung und die Untersuchung der Zellvitalität auf Gesamtgemelksebene durchzuführen, um eine prognostische Aussage zur Heilung des Euters zu erhalten. Wenn ein Tier im Laufe der Laktation eine klinische Mastitis entwickelt, sollen jene untersuchten Zellcharakteristika aus der vorangegangenen Milchleistungsprüfung die Bewertung der Mastitisprognose unterstützen. Somit sollen therapieunwürdige Tiere bestmöglich erkannt und eine Entscheidung zur Merzung getroffen werden können. Die Gesamtgemelke wurden zweimalig zentrifugiert, mit PBS-Puffer gewaschen, um die somatischen Zellen zu isolieren und schließlich durchflusszytometrisch analysiert, um den Anteil an großen, granulierten somatischen Zellen sowie den Anteil nicht-vitaler Zellen zu erfassen. Nachfolgend wurden die Daten des Analyseverfahrens auf Assoziationen mit der individuellen zytologischen Heilung der Kuh untersucht. Falls eine Kuh nach der Analyse eine klinische Mastitis entwickelte, wurde sie in eine zweite Teilstudie aufgenommen, um die bakteriologische Heilung zu untersuchen und diese ebenfalls mit den durchflusszytometrisch erfassten Parametern auf Beziehungen zu prüfen. Die Studie ergab, dass der gemessene Anteil an nicht-vitalen Zellen im Gesamtgemelk eine signifikante Beziehung zur zytologischen Heilung der Tiere aufwies. Ein höherer Anteil an nicht-vitalen Zellen war mit einer niedrigeren zytologischen Heilung assoziiert. Der Anteil an großen, granulierten Zellen ließ in dieser Studie auf keinen signifikanten Zusammenhang mit der Heilung schließen. Beziehungen der Zellparameter zu der bakteriologischen Heilung der Euterviertel konnten nicht festgestellt werden. Es ergibt sich die Schlussfolgerung, dass der Anteil nicht-vitaler Zellen in Gesamtgemelksproben der Milchleistungsprüfung eine prognostische Aussagekraft zur Heilung von Mastitiden besitzt. Somit ist eine Bewertung, ob eine antibiotische Therapie die Heilung der Milchdrüse signifikant positiv beeinflusst, möglich. Es besteht folglich eine Grundlage für die Integration der Zellvitalitätsuntersuchung in die standardisierten Laboruntersuchungen der Milchleistungsprüfung. Es ist jedoch anzumerken, dass die Leukozyten in der Milchdrüse und ihre Vitalität zahlreichen umwelt-, tier- und pathogenspezifischen Einflüssen unterliegen, die eine prognostische Bewertung der kuh-individuellen Heilung erschweren können. Eine Untersuchung der bakteriologischen Heilung auf pathogenspezifischer Ebene konnte in dieser Arbeit nicht einbezogen werden, allerdings könnten zukünftig diese Untersuchungen vielversprechende Ergebnisse liefern. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine durchflusszytometrische Methode mit unzentrifugierter Milch entwickelt. Dieses Schnellverfahren wurde nachfolgend auf eine Vorhersagekraft zur Heilung mit dem Ziel geprüft, die Zelldifferenzierung in die standardisierten Laboruntersuchungen der Milchleistungsprüfung zu integrieren. Da die Laboratorien der Landeskontrollverbände mehrere Tausend Milchproben pro Tag analysieren, ist es nötig die Probenpräparation für die Differenzierung zu vereinfachen. Weil sich Milchfette und – eiweiße häufig störend auf die durchflusszytometrische Analyse auswirken, werden in den meisten Fällen, wie auch im ersten Teil dieser Arbeit, Zentrifugationsschritte angewandt. Das Ziel dieses Versuchs war folglich die Entwicklung eines Verfahrens, mit welchem mehrere Tausend Proben in einigen Stunden analysiert werden können, das einfach durchführbar ist, eine hohe Testsicherheit aufweist und dabei wenig Verbrauchsmaterialien benötigt werden. Die Voruntersuchungen mit verschiedenen Milchverdünnungen ließen im niedrigen Fluoreszenzbereich aller Wellenlängenbereiche zahlreiche autofluoreszierende Milchbestandteile erkennen. Um diese Artefakte von somatischen Zellen trennen zu können, werden demzufolge stark fluoreszierende Farbstoffe benötigt. In dieser Studie konnte der Farbstoff Propidium Iodid im Komplex mit nicht-vitalen Zellen diesen Anforderungen gerecht werden. Allerdings emittiert dieser Farbstoff im Komplex mit vitalen somatischen Zellen nur eine schwache Fluoreszenz und wurde daher zusammen mit den autofluoreszierenden Milchbestandteilen detektiert. Da eine Quantifizierung der vitalen Zellen mit diesem Verfahren nicht möglich war, wurde im Folgenden die Zellzahl über ein fluorooptisches Zellzählsystem (SomaScope Smart) erfasst und der Anteil der nicht-vitalen Zellen an der Gesamtzellzahl auf diesem Weg ermittelt. Es konnten signifikante, aber schwache Korrelationen zwischen den Daten der Verfahren mit zentrifugierter und unzentrifugierter Milch bestätigt werden. Die Beurteilung der tierindividuellen zytologischen und bakteriologischen Heilungswahrscheinlichkeit anhand der Anteile nicht-vitaler Zellen in unzentrifugierter Rohmilch konnte in diesem Versuch jedoch nicht realisiert werden. Folglich erwies sich die in dieser Arbeit getestete durchflusszytometrische Methode mit unzentrifugierter Milch als nicht anwendbar, um eine prognostische Aussage zur Heilung einer klinischen Mastitis zu erhalten. Die Erfassung vitaler und nicht-vitaler Zellen innerhalb einer Messung und die Anwendung angepasster Fluoreszenzfarbstoffe erscheinen als maßgeblich, um eine höhere Testgenauigkeit zu erlangen.

Access State: Open Access

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