University thesis:
Dissertation, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau, 2021
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Abstract: Cytochrom-c-Oxidasen (Cox) terminieren mit ihrem binukleären Häm-Kupfer (Cu)- Zentrum die Atmungskette und sind essentiell für organisches Leben. Der Einbau des Kupferatoms in das binukleäre Zentrum verknüpft Kupferstoffwechsel mit dem As- semblierungsprozess der Cox-Enzyme und ist bis heute schlecht verstanden.<br>In dieser Arbeit wurde die Kupferassemblierung der cbb3-Typ Cytochrom-c-Oxidase (cbb3-Cox) und der Kupferstoffwechsel des Modellorganismus Rhodobacter capsula- tus (R. capsulatus) untersucht. Für eine funktionsfähige cbb3-Cox wird ein Kupferimp- ort (Cu(II)) und Export (Cu(I)) benötigt. Daher gibt es vermutlich einen cytoplasmati- schen Kupferreduktionsschritt. Bis jetzt sind keinerlei prokaryotische Reduktasen be- schrieben. In Eukaryoten gibt es membrangebundene Reduktasen bestehend aus Häm-Gruppen, Flavinen und NADPH. Nur in Archaeen gibt es ein Beispiel für eine lösliche Kupferreduktase mit Eisen-Schwefel-Clustern. In dieser Arbeit wurde das bis dahin uncharakterisierte Membranprotein CcoG auf eine Verbindung zur cbb3-Cox und auf eine mögliche Kupferreduktaseaktivität getestet.<br>In Vergleichen zwischen Knockout und Wildtyp konnte gezeigt werden, dass CcoG für optimales semi-aerobes Wachstum benötigt wird. Passend dazu wird die cbb3-Cox vor allem unter semi-aeroben Bedingungen exprimiert und ein CcoG-Knockout vermin- derte die Cox-Aktivität deutlich. Zusätzlich vermittelt CcoG eine Kupfertoleranz, denn die CcoG-Knockout-Stämme waren kupfersensibel und Überexpressionsstämme re- sistenter als der Wildtyp. Somit verbindet CcoG Kupferstoffwechsel und Assemblie- rung der cbb3-Cox.<br>Anschließend wurde gezeigt, dass alle vier in CcoG vorhandenen Cysteincluster un- erlässlich für optimales Wachstum und Cox-Aktivität sind. Mithilfe von Mikroskala- Thermophorese und Spektralphotometrie wurde an aufgereinigtem Protein gezeigt, dass zwei dieser Cysteincluster Kupfer binden und mithilfe von EPR wurde an Memb- ranen nachgewiesen, dass die beiden anderen Cysteincluster zwei vierkernige Eisen- Schwefel-Cluster koordinieren.<br>In einem letzten Experiment konnte schließlich nachgewiesen werden, dass heterolog überexprimiertes CcoG Cu(II) zu Cu(I) reduzieren kann. Damit begründet CcoG eine vollkommen neue Klasse an membrangebundenen Kupferreduktasen und ist die erste beschriebene Kupferreduktase in Prokaryoten