Mechanistic and biocatalytic investigation of glutathione-dependent, ligninolytic enzymes

Media type: E-Book; Thesis

Title: Mechanistic and biocatalytic investigation of glutathione-dependent, ligninolytic enzymes

Contributor: Husarčíková, Jana [VerfasserIn]; Schallmey, Anett [AkademischeR BetreuerIn]; Jahn, Dieter [AkademischeR BetreuerIn]

Corporation: Technische Universität Braunschweig

imprint: Braunschweig: Technische Universität Braunschweig, 2021

Extent: 1 Online-Ressource (PDF-Datei: 6 MB)

Language: English

DOI: 10.24355/dbbs.084-202111220847-0

Identifier:

Keywords: Hochschulschrift

Origination:

University thesis: Dissertation, Technische Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig, 2020

Footnote: Zusammenfassung in deutscher und englischer Sprache

Description: The current demand for more environmentally benign processes requires the investigation of alternative renewable resources in different industry sectors to become independent from fossil fuels. Lignin, as a major polymer present in nature, contains significant amounts of aromatic building blocks and thus, is considered a valuable renewable feedstock for the future supply of aromatics. For that reason, the depolymerization and valorization of this commodity in biorefineries via various chemical and enzymatic approaches is of high importance. Several enzymes are known to act on lignin, but β-etherases together with glutathione lyases catalyze the selective cleavage of β-O-4 aryl ether bonds present in lignin in a highly stereoselective manner. These enzymes, belonging to the glutathione-S-transferase superfamily, catalyze a reductive, glutathione-dependent ether bond cleavage. In this thesis, a whole-cell catalyst combining β-etherases and glutathione lyase was studied in order to overcome the enzymes' glutathione dependence, which is regarded as a major limitation for their application in the production of aromatics from lignin polymer and its oligomers. Therefore, the whole-cell catalyst was investigated for efficient cleavage of the β-O-4 aryl ether bond in a lignin model substrate with intracellular GSH regeneration. This revealed that up to 5 mM of this substrate could be converted without addition of external GSH or carbon source. The applicability of the whole-cell process was successfully demonstrated in the kinetic resolution of the racemic lignin model substrate to provide enantiopure compounds. Understanding the catalytic mechanism of an enzyme is one of the crucial requirements for its successful application. In that matter, a thorough analysis of the active sites of β-etherases LigE and LigF from Sphingobium sp. SYK-6 is presented, expanding our knowledge on the impact of different active-site residues on catalytic efficiency. By introducing mutations into the active sites of LigE and LigF, residues important for GSH-activation and catalysis have been identified. Additionally, multiple LigF mutants with significantly improved activity were obtained, representing an excellent starting point for further protein engineering. Moreover, the substrate scope of β-etherases was expanded to non-lignin-derived, bisphenol A-related compounds in this thesis, demonstrating the potential of these enzymes for the degradation of other, man-made structures. ; Die steigende Nachfrage nach umweltfreundlicheren und nachhaltigeren Prozessen erfordert auch eine vermehrte Verwendung von nachwachsenden Rohstoffen in der Industrie. Lignin, das am häufigsten vorkommende aromatische Polymer in der Natur, stellt dabei einen wertvollen Ausgangsstoff für die zukünftige Gewinnung aromatischer Verbindungen dar. Aus diesem Grund ist die Entwicklung von chemischen und enzymatischen Verfahren zum gezielten Abbau von Lignin von großer Bedeutung. In der Natur existieren verschiedene Enzyme, welche am Ligninabbau beteiligt sind. Davon sind besonders β-Etherasen zusammen mit Glutathionlyasen interessant, da diese selektiv und stereospezifisch β-O-4-Aryletherbindungen, der häufigsten Bindungstyp im Ligninpolymer, spalten können. Beide Enzymgruppen gehören zur Superfamilie der Glutathion-S-transferasen und katalysieren zusammen eine reduktive Etherbindungsspaltung mit Hilfe von Glutathion. Die Glutathionabhängigkeit der Enzyme stellt dabei einen Nachteil für deren industrielle Anwendung dar. Innerhalb dieser Arbeit wurde deshalb ein auf Escherichia coli-basierender Ganzzellbiokatalysator zur intrazellulären Bereitstellung und Rezyklierung des benötigten Glutathions untersucht. Durch Kombination zwei enantiokomplementärer β-Etherasen und einer unselektiven Glutathionlyase in E. coli konnten dabei ohne externe Zugabe von Glutathion oder einer Kohlenstoffquelle bis zu 5 mM eines Ligninmodellsubstrates im Ganzzellsystem umgesetzt werden. Zudem wurde die Anwendbarkeit des Systems im präparativen Maßstab anhand der kinetischen Racematspaltung eines racemischen Ligninmodellsubstrates erfolgreich demonstriert. Desweiteren wurde der Katalysemechanismus der β-Etherasen LigE und LigF aus Sphingobium sp. SYK-6 genauer untersucht, um den Einfluss jeder einzelnen Aminosäure im aktiven Zentrum auf die katalytische Effizienz der Enzyme besser zu verstehen. Durch gezielte Mutagenese konnten dabei einerseits wichtige Aminosäurereste für die Glutathionaktivierung und Katalyse identifiziert werden. Gleichzeitig wurden im Fall von LigF zudem Enzymmutanten mit deutlich erhöhter Aktivität erhalten, welche einen guten Ausgangspunkt für die weitere Optimierung der β-Etherase durch Methoden des protein engineerings darstellen. Im letzten Teil der Arbeit konnte zudem das Substratspektrum der β-Etherasen über die Umsetzung von β-O-4-Aryletherbindungen im Lignin hinaus erweitert werden. Die hier gezeigte Öffnung von Epoxidringen und Spaltung von Aryletherbindungen in Bisphenol A-abgeleiteten Verbindungen verdeutlicht dabei das Potential der β-Etherasen für den Abbau von künstlichen, anthropogenen Verbindungen.

Access State: Open Access

Search in field:

Recently searched for: