Isolation, Aufreinigung und Kultivierung von Fibroblasten aus dem Spiralganglion

Media type: E-Book; Thesis

Title: Isolation, Aufreinigung und Kultivierung von Fibroblasten aus dem Spiralganglion

Other titles: Übersetzung: Isolation, purification and cultivation of fibroblasts from the spiral ganglion

Contributor: Anacker, Annett [VerfasserIn]; Esser, Karl-Heinz [AkademischeR BetreuerIn]; Warnecke, Athanasia [AkademischeR BetreuerIn]; Paasche, Gerrit [AkademischeR BetreuerIn]

Corporation: Tierärztliche Hochschule Hannover

imprint: Hannover: Tierärztliche Hochschule Hannover, 2021

Extent: 1 Online-Ressource (199 Seiten); Illustrationen, Diagramme

Language: German

Identifier:

Keywords: Hochschulschrift > Dissertation

Origination:

University thesis: Dissertation, Tierärztliche Hochschule Hannover, 2021

Footnote: Zusammenfassungen in deutscher und englischer Sprache

Description: Die Beeinträchtigung des Hörvermögens durch Hörminderung und Taubheit stellt einen weit verbreiteten Krankheitskomplex dar. Allein in Deutschland sind mehr als 19 % der Gesamtbevölkerung von Schwerhörigkeit betroffen. Durch die Einführung des Cochlea-Implantats (CI), einer elektronischen Innenohrprothese, ist es möglich Patienten mit vollständig sensorineuralem Hörverlust ein Hörempfinden und somit ein Sprachverständnis zu vermitteln. Der Nutzen eines CI lässt jedoch große interindividuelle Unterschiede erkennen, was zum einen in der Anzahl funktionsfähiger Spiralganglionneurone (SGN) und zum anderen in der Nerv-Elektroden-Interaktion begründet liegt. Bei Cochlea-Implantation bildet sich ein Bindegewebemantel um den Elektrodenträger, was eine Vergrößerung des Widerstandes für die elektrische Stimulation des Hörnervs zur Folge hat. Um langfristig eine Optimierung der Nerv-Elektroden-Grenzfläche zu erzielen und einen engen Nerv-Elektroden-Kontakt zu schaffen, wird in verschiedenen Forschungsvorhaben der Einfluss von Medikamenten, Oberflächenmodifikationen oder elektrischer Stimulation auf innenohr-spezifische Zellen untersucht. Hierfür ist es notwendig, die Auswirkungen auf die unterschiedlichen Zelltypen separat untersuchen zu können. Protektive Effekte auf SGN neonataler SPRAGUE-DAWLEY-Ratten konnten bereits nachgewiesen werden. Die Gewinnung der Zellen gehört dabei zu den vorhandenen Standardverfahren, wobei man neben den SGN vorrangig auch Gliazellen und Fibroblasten erhält. Um die Effekte auf das Wachstums- und Adhäsionsverhalten cochleärer Fibroblasten untersuchen zu können, sollen für die In-vitro-Versuche aufgereinigte Fibroblasten aus dem Spiralganglion (SpG) zur Verfügung gestellt werden. Die Ziele der vorliegenden Arbeit lagen in dem immunzytochemischen Nachweis der Zellen des Spiralganglions neonataler SPRAGUE-DAWLEY-Ratten sowie in der Gewinnung und Aufreinigung von Fibroblasten aus dieser Zellmischkultur. Zusätzlich sollten die cochleären Fibroblasten immunzytochemisch weiter charakterisiert werden. Für den Nachweis der Zellen in der dissoziierten Spiralganglionzellkultur wurde ein immunzytochemisches Färbeprotokoll etabliert. Die optimalen Anwendungskonzentrationen der einzelnen Antikörper (Ak) wurden in verschiedenen Verdünnungsreihen ermittelt und an entsprechenden positiven Zelllinien getestet. Die dissoziierten Spiralganglionzellen wurden in beschichteten Multiwellplatten nach 48 h Kultivierungsdauer fixiert und mittels indirektem Mehrfach-Immunfluoreszenzverfahren anhand zellspezifischer, intrazellulärer Proteine immunzytochemisch gefärbt. Zusätzlich wurden alle Zellkerne mit der DAPI-Kernfärbung markiert. Für eine Differenzierung der Zellen erwiesen sich Ak gegen das 200kD-Neurofilament (NF) der SGN, das S100B-Protein der Gliazellen (GZ) sowie gegen das Intermediärfilament (IF) Vimentin in Fibroblasten und GZ als geeignet. Mit dieser Ak-Kombination konnten alle Zellen in der Spiralganglionzellkultur immunzytochemisch markiert und anhand ihres Fluoreszenzsignals sowie ihrer morphologischen Eigenschaften unterschieden werden. Der Anteil an GZ lag dabei mit 60-70 % über dem Anteil an Fibroblasten. Für die Gewinnung und Aufreinigung der Fibroblasten aus dem SpG wurden zunächst die Kulturbedingungen geändert. Dabei wurde auf eine Beschichtung der Kulturgefäße verzichtet und das sonst übliche Medium auf fibroblastenspezifisches Medium umgestellt. Die Zellmischkultur wurde in 25-cm2-Zellkulturflaschen (T25) kultiviert und subkultiviert, wobei eine optimale Einsaatdichte von 3x105 Zellen/T25 ermittelt wurde. Bereits nach der ersten Passage (P1) konnten keine SGN mehr nachgewiesen werden, während sich der Anteil an GZ auf etwa 20-30 % reduzierte, bei höheren Passagen aber dann konstant blieb. Für eine weitere Aufreinigung wurde die Wirkung des Ca2+-Chelators EGTA untersucht. Die Zellen wurden sowohl in Laminin-beschichteten als auch in unbeschichteten Kulturgefäßen kultiviert und subkultiviert, wobei in den beschichteten Ansätzen keine selektivere Ablösung der Gliazellen beobachtet werden konnte. Bei beiden Ansätzen konnte zwar eine hohe Aufreinigung der Fibroblasten von etwa 90-95 % erreicht werden, aber eine weitere Vermehrung und Kultivierung der Fibroblasten war anschließend nicht mehr möglich. Für die Anwendung der fluoreszenzbasierten, durchflusszytometrischen Zellsortierung wurden die Zellen der primären Spiralganglionzellkultur (P0) mit Ak gegen den p75NGF-Rezeptor sowie das Thy1-Protein an ihrer Oberfläche markiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Fibroblasten ausschließlich Thy1-positiv und Gliazellen ausschließlich p75NGFR-positiv waren, während die SGN beide Proteine exprimierten. Durch Kultivierung und Subkultivierung wurden die SGN aus der Zellmischkultur (P1) entfernt und die Fibroblasten vermehrt. Für die Zellsortierung wurden die vitalen Zellen der zweiten Passage (P2) mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern gegen die zellspezifischen Oberflächenproteine markiert und anschließend, entsprechend ihrer unterschiedlichen Fluoreszenzsignale, im Durchflusszytometer getrennt. Dabei konnte eine Aufreinigung der Fibroblasten von > 99 % erreicht werden. Bei der immunzytochemischen Charakterisierung der aufgereinigten Fibroblasten konnte gezeigt werden, dass diese positiv für das IF Vimentin, das Enzym Carboanhydrase-II (CAII), das S100-Protein sowie das Gap-junction-Protein Connexin-26 (Cx26) waren und damit dem immunhistochemischen Profil der Fibroblasten des Spiralligaments vom Typ I entsprachen. Eine Kultivierung und Subkultivierung der aufgereinigten Fibroblasten war bis zu 16 Passagen über 11 Wochen möglich. Bei Kryokonservierung der Fibroblasten (P5) lag die Überlebensrate bei etwa 80 % der Zellen, wobei diese ihre typische Fibroblastenmorphologie und Merkmale der Zellteilung beibehielten. Da Zellkulturen aus tierschutzrelevanten Aspekten vermehrt serumfrei kultiviert und durch die Verwendung chemisch-definierter, bestenfalls tierkomponentenfreier, Ersatzseren möglichst standardisiert werden sollten, wurden die aufgereinigten Fibroblasten in einem ersten Ausblick ebenfalls serumfrei kultiviert, subkultiviert und kryokonserviert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Anzahl an Fibroblasten bei Subkultivierung im Vergleich zu den serumhaltigen Ansätzen zwar um 20 % reduziert war, aber die Zellen weder in ihren morphologischen Eigenschaften noch in ihrer Adhärenz verändert waren. Auch bei der serumfreien Kryokonservierung konnte eine Überlebensrate von 80 % erreicht werden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Fibroblasten aus dissoziierten Spiralganglionzellen durch Kultivierung und Subkultivierung sowie durch die Methode der fluoreszenzbasierten, durchflusszytometrischen Zellsortierung isoliert, aufgereinigt und vermehrt werden können. Durch die Kryokonservierung ist zudem eine Langzeitlagerung der Zellen möglich, ohne ihre Vitalität und spezifischen Eigenschaften erheblich zu beeinflussen. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit erstmalig aufgereinigte Fibroblasten aus dem Spiralganglion für zukünftige In-vitro-Versuche zur Verfügung gestellt werden, welche den Eigenschaften der Zellen in vivo am ehesten entsprechen.

Access State: Open Access

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