Die Rolle des Transkriptionsfaktors IscR aus dem marinen Modellbakterium Dinoroseobacter shibae in der Anpassung an Eisenmangelbedingungen: von Lisa Plötzky

Media type: E-Book; Thesis

Title: Die Rolle des Transkriptionsfaktors IscR aus dem marinen Modellbakterium Dinoroseobacter shibae in der Anpassung an Eisenmangelbedingungen : von Lisa Plötzky

Contributor: Plötzky, Lisa [VerfasserIn]; Jahn, Dieter [AkademischeR BetreuerIn]; Bröring, Martin [AkademischeR BetreuerIn]

Corporation: Technische Universität Braunschweig

imprint: Braunschweig, 2021

Extent: 1 Online-Ressource (PDF-Datei: 7 MB)

Language: German

DOI: 10.24355/dbbs.084-202112151647-0

Identifier:

Keywords: Hochschulschrift

Origination:

University thesis: Dissertation, Technische Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig, 2021

Footnote: Zusammenfassung in deutscher und englischer Sprache

Description: In dieser Arbeit wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors IscR aus D. shibae für die Anpassung an Eisenmangelbedingungen analysiert. Dazu wurden zuerst Wachstumsexperimente durchgeführt, welche die Bedeutung von IscR für das Wachstum des marinen Bakteriums in der Anwesenheit von Eisen zeigten. Mit Hilfe von UV/Vis Spektroskopie des rekombinant produzierten und gereingten IscR Proteins konnte die Koordination von Häm als Kofaktor nachgewiesen werden. Weiterhin wurden mit gleicher Methodik und mutierten IscR Proteinen zwei Histidine an den AS-Positionen 91 und 125 als potentielle Liganden für die Bindung des Häms identifiziert. Durch Kristallisationsexperimente konnte erstmals die Struktur von D. shibae IscR gelöst werden, welche eine für Rrf2-Transkriptionsfaktoren typische Dimerisierungs- und DNA-Bindedomäne (wHTH) zeigte. Die Ko-Kristallisationsexperimente von IscR und Häm konnten allerdings verdeutlichen, dass sich Häm unspezifisch an IscR anlagert und mit keinen der potentiellen Liganden interagiert. Weiterhin wurde mit Hilfe eines in vivo Komplementationssystems gezeigt, dass die potentiellen Histidin-Liganden nicht für die Häm-Bindung essentiell sind. In der Kristallstruktur bilden zwei gegenüberliegende Häm-Moleküle eine β-Hämatin Struktur in einem Solvenskanal des Proteins aus. Eine Vielzahl verschiedener experimenteller Ansätze änderte an der artifiziellen Häm-Bindung nichts. Die nachfolgenden physiologischen Untersuchungen bestätigten diese Beobachtungen, da mit Hilfe von Transkriptomanalysen keine durch IscR spezifische Häm-abhängige Regulation der Gene für die Eisen- bzw. Hämaufnahme nachgewiesen werden konnte. Während der Mutationsstudien mit IscR zeigte Cys 140 eine funktionelle Rolle für die Genregulation in Anwesenheit von Eisen in vivo. Um die Bedeutung des Cysteinrestes zu charakterisieren wurde eine Metalltitration von IscR mit unterschiedlichen zweiwertigen Metallionen durchgeführt, um einen möglichen Kofaktor von IscR zu identifizieren. Die Bindung eines zweiwertigen Metallions als Kofaktor konnte jedoch durch die Metalltitration und Metall-abhängigen DNA/Protein Bindungsstudien nicht belegt werden. Schließlich konnten durch Gelretardationsanalysen im hemB2 Promotor zwei Bindestellen von IscR mit dem Sequenzmotiv 5'-TTAA-N10-AATT-3' bzw. 5'-TTAA-N20-AATT-3' identifiziert werden und dadurch eine mögliche Ko-Regulation von RirA und IscR gezeigt werden. Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit die erste Struktur von IscR aus D. shibae aufgeklärt, Häm als dessen Kofaktor ausgeschlossen und eine neuartige DNA-Bindestelle funktionell identifziert werden und so deutlich zum Verständnis der Eisenregulation in einem marien Modellorganismus beigetragen werden. ; In this thesis, the role of the transcription factor IscR of the marine model bacterium Dinoroseobacter shibae in the adaptation to iron deficiency conditions was analyzed. Comparative growth experiments of D. shibae and a corresponding iscR mutant showed the importance of IscR for the growth of the bacterium in the presence of iron. UV/Vis spectroscopy of the recombinantly produced and purified IscR protein indicated the coordination of heme as a cofactor. Two histidines at amino acid positions 91 and 125 were identified as potential heme ligands. Crystallization experiments resulted in the first atomic structure of D. shibae IscR, which revealed a dimerization and DNA-binding domain (wHTH) typical for Rrf2-type transcription factors. However, co-crystallization experiments of IscR and heme clarified that the tetrapyrrol binds non-specifically to IscR and does not interact with any of the potential ligands. Furthermore, using an in vivo complementation system, it was shown that the potential histidine ligands are not essential for heme binding. In the solved crystal structure, two stacked heme molecules form a β-hematin structure in a solvent channel of the protein. A variety of different experimental approaches did not change the observed artificial heme binding. Subsequent physiological studies confirmed these observations, as transcriptome analyses did not detect IscR-specific heme-dependent regulation of iron or hemin uptake genes. The mutation studies with IscR further indicated a functional role of Cys 140 for gene regulation in the presence of iron in vivo. However, the binding of a divalent metal ion as a cofactor could not be substantiated by the metal titration and metal-dependent DNA/protein binding studies. Finally, electro mobility shift assays identified two binding sites of IscR in the hemB2 promoter with the sequence motif 5'-TTAA-N10-AATT-3' and 5'-TTAA-N20-AATT-3', respectively, demonstrating a possible co-regulation of RirA and IscR during the adaptation to changing iron concentrations in the environment. In summary, this work elucidated the first structure of IscR of D. shibae, excluded heme as its cofactor, and functionally identified a novel DNA-binding site, thus contributing significantly to the understanding of iron regulation in a marine model bacterium.

Access State: Open Access

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