imprint:
[Erscheinungsort nicht ermittelbar]: Universidade de Aveiro, 2008
Language:
Portuguese
Identifier:
Origination:
University thesis:
Dissertation, Universidade de Aveiro, 2008
Footnote:
Description:
Doutoramento em Biologia ; O transporte de cálcio pelas vesículas sinápticas regula a duração da neurotransmissão: Como partir de uma actividade para chegar a uma função biológica e à identificação da proteína que a confere. A neurotransmissão rápida ocorre na escala de tempo do milisegundo. Esta inclui I) A entrada rápida de Ca2+ para dentro da célula através dos canais de cálcio sensíveis a voltagem. II) A activação do mecanismo de libertação de neurotransmissor sensível a cálcio. III) A difusão através da fenda sináptica IV) A activação dos receptores pós-sinápticos V) A terminação da sinalização Um dos acontecimentos chave neste processo é que a elevação da concentração de Ca2+ no terminal sináptico tem de ser transitória, suficientemente elevada para garantir que a secreção ocorra num ápice e não perdure no tempo de modo a comprometer a janela de tempo" da secreção ( 100 μM durante menos de 300 μs. No nosso laboratório foi identificada uma tal actividade de transporte de Ca2+ energizada pelo gradiente de protões vesicular. Um trocador de Ca2+/H+ em vesículas sinápticas de córtex cerebral de carneiro, activo para uma gama de concentrações de Ca2+ relativamente elevada, entre os 100 e os 800 μM (máxima actividade aos 500 μM). A velocidade do transporte de Ca2+ por este antiporta depende do gradiente de H+ através da membrana vesicular que é mantido pela actividade da H+-ATPase do tipo V e passível de ser inibida especificamente pela bafilomicina A1. Também o ião Sr2+ inibe o trocador de Ca2+/H+ (sem afectar o gradiente de H+ vesicular). Estes dois inibidores foram utilizados para por em evidência a participação do trocador de Ca2+/H+ vesicular na regulação da secreção da acetilcolina (ACh) nas sinapses do órgão eléctrico de Torpedo marmorata. Quer o Sr2+, prevenindo a sequestração vesicular de iões, quer a bafilomicina, que dissipa o gradiente de H+, induziram um aumento no tempo de resposta pós-sináptica de 2 ms para até ~10 ms, devido à persistência da libertação de ACh. Os electrócitos do órgão eléctrico de Torpedo permitiram acompanhar esta libertação de ACh em tempo real através da medição da corrente eléctrica gerada pelo órgão eléctrico em resposta à ACh. Esta preparação permitiu simultaneamente a marcação da ACh libertada com 14C, evidenciando assim a natureza pré-sináptica do aumento da libertação de ACh. Este aumento foi ainda confirmado em sinaptossomas isolados a partir do mesmo órgão, desta vez utilizando a quimioluminescência como técnica de visualização da libertação de ACh. Ficou demonstrado que a principal função do antiporte de Ca2+/H+ vesicular é a de restringir, no tempo, a libertação de neurotransmissor. Não se exclui, contudo, que essa mesma sequestração participe igualmente na homeostasia do Ca2+ "ajudando" a acção da Ca2+-ATPase vesicular a manter os níveis basais de Ca2+. Agora que sabíamos o que o antiporte faz queríamos saber qual a proteína que o codificava. Para tal partimos da hipótese que a sinaptotagmina I codificava o nosso transportador. Usámos clones de células PC-12 em cultura que não exprimiam a sinaptotagmina (-/-) e comparámos a actividade de antiporte vesicular dessas células com a actividade nas células exprimindo a proteína (+/+). A perda de actividade nas células -/- foi de 100% relativamente às +/+. De modo a certificarmo-nos deste resultado usámos células -/- transfectadas com o gene da sinaptotagmina I ao qual foi fusionada uma sequência tetracisteínica (Cis-Cis-Arg-Glu-Cis-Cis) na proteína de fusão. Esta sequência é capaz de reconhecer uma sonda biarsénica, fluorescente quando ligada à proteína de fusão, e passível de criar radicais livres de alta reactividade (singletos de oxigénio) quando exposta a luz ultravioleta de alta intensidade. Técnica conhecida por "fluorescein-assisted light inactivation" ou FlAsh- FALI. Por este método pudemos verificar que a actividade de antiporte de Ca2+/H+ vesicular requer uma sinaptotagmina I funcional, usando ensaios de transporte de 45Ca2+ e uma sonda fluorescente sensível a protões.