Published:
[Erscheinungsort nicht ermittelbar]: [Verlag nicht ermittelbar], 2014
Language:
Spanish
Identifier:
Origination:
University thesis:
Dissertation, 2014
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Description:
Tesis doctoral inédita. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 13-11-2013 ; En los últimos años se ha descrito el papel de la DNA polimerasa de la Familia X Polλ en el mecanismo de reparación por reunión de extremos no homólogos (NHEJ) y su interacción con los factores implicados en el mismo. A lo largo de esta Tesis Doctoral hemos puesto a punto un ensayo in vitro de reparación por NHEJ en ausencia de los factores auxiliares para Polλ, estudiando la fidelidad del proceso, la dependencia del metal y la complementariedad mínima necesaria para llevarlo a cabo. Puesto que las roturas de DNA casi nunca producen extremos protuberantes compatibles hemos profundizado en la capacidad de Polλ de resolver roturas cuyos extremos no son los idóneos, demostrando que es capaz de tolerar desapareamientos y bases extra, así como daños en el DNA tan comunes como la 8oxoG. La eficiencia de la reacción de NHEJ fue estudiada en función de la distancia entre los gaps que flanquean la rotura, del tamaño de los mismos y del tipo de complementariedad que forman los extremos del DNA. El papel de Polμ, también miembro de la Familia X, en la reparación de roturas de doble cadena por NHEJ también ha sido ampliamente estudiado con anterioridad. Sin embargo, Polλ y Polμ parecen no tener un papel redundante en este mecanismo. Existen dos dominios específicos que las diferencian: el Loop 1 (grande y móvil en Polμ y pequeño en Polλ) y el nail" (presente en Polλ, pero ausente en Polμ). Hemos profundizado en el estudio estructura-función de Polλ mediante la obtención de proteínas quiméricas en las que tanto el Loop 1 de Polλ como la región del nail han sido intercambiados por los de Polμ. Así, observamos que ambos dominios no son intercambiables y que confieren identidad propia a cada polimerasa, estando íntimamente relacionados con sus propiedades bioquímicas y su especificidad durante las reacciones de NHEJ. El análisis estructural de Polλ ha sido completado con el intercambio de su dominio BRCT por el de Polμ (con el que comparte un 23% de identidad de secuencia de aminoácidos). En esta Tesis Doctoral se analiza asimismo una región de Polλ no caracterizada previamente denominada "broche". Esta región esta formada por 5 residuos (WVCAQ) situados entre el dominio Ser-Pro y el core tipo Polß. Mediante mutagénesis dirigida, hemos demostrado la importancia del broche en el mantenimiento de una conformación cerrada a lo largo de su ciclo catalítico. Alteraciones de los residuos más conservados de esta región provocan una disminución en la eficiencia con la que Polλ lleva a cabo sus funciones. Por último, a lo largo de este trabajo hemos caracterizado bioquímicamente algunos de los polimorfismos naturales (SNP) de Polλ e isoformas asociadas a procesos tumorales. Todas las variantes estudiadas pudieron formar complejos estables E:DNA y llevar a cabo una síntesis distributiva, además de mantener su actividad dRP liasa. Sin embargo, algunas de ellas presentaron un comportamiento alterado en la tolerancia al DNA, en la extensión de desapareamientos o en la reparación de roturas en el DNA por NHEJ. Debemos destacar que el polimorfismo R487W tiene alterados sus parámetros cinéticos como consecuencia de la modificación estructural que provoca este cambio en el dominio "palma".