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Moure González, Raquel
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Detección rápida de Mycobacterium tuberculosis complex y de la resistencia a los fármacos antituberculosos mediante métodos de amplificación genética e hibridación
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- Media type: E-Book
- Title: Detección rápida de Mycobacterium tuberculosis complex y de la resistencia a los fármacos antituberculosos mediante métodos de amplificación genética e hibridación
- Contributor: Moure González, Raquel [Author]
-
Published:
[Erscheinungsort nicht ermittelbar]: Universitat de Barcelona, 2013
- Language: Spanish
- Identifier:
- Origination:
- University thesis: Dissertation, Universitat de Barcelona, 2013
- Footnote:
- Description: [spa] El diagnóstico de la tuberculosis (TB) se basa en gran medida en métodos microbiológicos convencionales: a) un cribado mediante microscopía de bacilos ácido-alcohol resistentes que permite de forma rápida, sencilla y económica una primera orientación hacia el diagnóstico de TB en caso de que la baciloscopia sea positiva; y b) el cultivo de las muestras clínicas en medios específicos para micobacterias. El cultivo micobacteriano es el método considerado gold standard en el diagnóstico microbiológico de la TB, y además, permite obtener el aislamiento clínico con el que posteriormente se puede estudiar la sensibilidad a los fármacos antituberculosos o realizar análisis epidemiológicos. Sin embargo, estos métodos fenotípicos convencionales son insuficientes para un control eficaz de la tuberculosis, debido sobre todo a la baja sensibilidad de la microscopía y a la lentitud del cultivo micobacteriano. En este sentido se han desarrollado técnicas basadas en la amplificación genómica por PCR (polymerase chain reaction) y posterior estudio post-amplificación, fundamentalmente mediante hibridación en fase líquida o sólida, con sondas complementarias a los genes de interés, tanto para la detección del microorganismo como de su resistencia a los fármacos. En esta tesis se trata de evaluar, en un primer bloque, dos de los sistemas comerciales más recientes para el diagnóstico rápido de la TB. Uno de ellos es el sistema integrado de PCR a tiempo real, Xpert MTB/RIF (Cepheid, EEUU). Así se propuso determinar la eficacia de este sistema en casos de alta sospecha de tuberculosis y baciloscopia negativa, en nuestra área. En términos de sensibilidad se detectó un 78,2% de los casos de tuberculosis pulmonar y un 58,3% en los casos de tuberculosis extrapulmonar. Además, se determinó, en un estudio de rentabilidad potencial del uso en rutina de esta técnica, que el uso del Xpert MTB/RIF puede adelantar en una media de una semana el inicio del tratamiento antituberculoso, además de ahorrar recursos económicos en el diagnóstico (hasta 2000 euros). Por otro lado, la evaluación el sistema GenoQuick MTB (Hain LIfescience, Alemania) de PCR convencional y posterior hibridación rápida en fase sólida (lateral-flow dipstick), mostró a esta técnica como una alternativa a la previamente descrita al comprobarse que la sensibilidad obtenida en muestras con baciloscopia negativa fue de 78,1%, con una discreta mayor complejidad técnica pero también con un menor coste económico. Estos sistemas de PCR e hibridación se revelan como métodos muy útiles para la detección directa en muestra clínica de M. tuberculosis complex. Otro aspecto muy relevante, sobre el que también se ha investigado en los últimos años, es el de la detección de mutaciones genéticas implicadas en la resistencia a los principales fármacos antituberculosos. De esta forma se planteó, en un segundo bloque de la tesis, el diseño y desarrollo de un sistema propio de microarrays (sistemas miniaturizados de amplificación e hibridación con oligonucleótidos fijados en una matriz orgánica) para la detección rápida de la resistencia de algunos de los fármacos antituberculosos más importantes. Tras caracterizar las mutaciones presentes en los aislamientos resistentes de nuestra área y basándose también en las mutaciones más frecuentemente descritas en la literatura, se diseñaron dos microarrays de baja densidad y bajo coste, 1) para la detección de mutaciones relacionadas con la resistencia a la estreptomicina y las fluoroquinolonas (obteniéndose una sensibilidad del 92,5% y el 87,5%, respectivamente; y 2) al etambutol (con una sensibilidad y especificidad del 100%). Este sistema de microarrays se plantea como una buena alternativa a los sistemas comercialmente disponibles, al tener un coste económico menor y ofrecer la flexibilidad de añadir más o diferentes dianas de resistencia, en función del perfil de mutaciones de cada área geográfica. ; [eng] Tuberculosis remains one of the biggest health threats, causing around 8.5 million of new cases and 1.5 million deaths worldwide, each year. The two cornerstones for the tuberculosis control are rapid diagnosis and rapid detection of drug resistance, allowing prompt initiation of the adequate pharmacological treatment and avoiding the spread of the disease to other individuals. Conventional microbiological methodologies for tuberculosis diagnosis are the smear microscopy and the mycobacterial culture. Nevertheless, the microscopy has low sensitivity especially in cases of extrapulmonary tuberculosis, and Mycobacterium tuberculosis complex culture is very slow. In the past two decades, molecular methodologies have emerged as valuable tools for rapid diagnosis in the field of tuberculosis. In the first block of the thesis, we determined the effectiveness of two techniques for direct detection of M. tuberculosis complex. The sensitivity of the Xpert MTB/RIF (Cepheid) was 78.2% in pulmonary samples and 58.3% in extrapulmonary specimens, all smear-negative. The sensitivity of the GenoQuick MTB (Hain Lifescience) was 78.1% among smear-negative specimens. Given the high economical cost of the Xpert MTB/RIF test, but once proven its advantages for rapid diagnosis, we tried to determine the potential cost-effectiveness of using this technique in daily routine, in an area of low-medium incidence of tuberculosis. In terms of economical costs, the performance of the Xpert MTB/RIF could save a median of 2,000 € among smearnegative patients. In the second part of the thesis, we developed and evaluated a low-cost low-density microarray (LD-SQ) designed for the detection of the main mutations most frequently described to be related to streptomycin, second-line anti-tuberculous injectable drugs (rrs and rpsL genes) and fluoroquinolones (gyrA gene). The microarray detected 92.5% of the mutations related to streptomycin and 87.5% to fluoroquinolones. We also characterized the most prevalent embB mutations related to resistance to ethambutol in our area, and developed a low-cost low-density microarray (LD-EMB) for the rapid detection of these mutations, obtaining a 100% of sensitivity and specificity. The microarray platforms developed for rapid detection of streptomycin, fluoroquinolones and ethambutol showed up as an alternative for rapid diagnosis of drug resistance, with the advantage, compared to other commercially available techniques, of being lower cost and including more targets and codon substitutions, as well as the flexibility to exchange them, depending on the needs of each setting.
- Access State: Open Access