imprint:
[Erscheinungsort nicht ermittelbar]: [Verlag nicht ermittelbar], 2010
Language:
English
Identifier:
Origination:
University thesis:
Dissertation, 2010
Footnote:
Description:
Das Ziel dieser Arbeit war, das Pheromon-induzierbare pSip Expressionssystem auf die Eignung zur food grade" Produktion von bakteriellen -Galactosidasen mit Lactobacillus als "Zellfabrik" zu untersuchen. Die induzierbare Überexpression verschiedener -Galactosidase codierender Gene (lacLM) wurde mittels quantitativer real-time PCR (real time-PCR) auf mRNA-Ebene erforscht. Weiters wurden Lactobacillen unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen kultiviert und einige molekularbiologische Ansätze zur Modifikation des pSip-Systems angewandt, um eine höhere Ausbeute von - Galactosidasen zu erzielen. Real time-PCR Analyse der Expression des regulatorischen 2-Komponenten-Systems bestehend aus Histidin-Kinase-Gen (sppK) und Response-Regulator (sppR), sowie der lacLM Gene aus L. reuteri und L. acidophilus im pSip409 Expressionsystem zeigte, dass die Unterschiede in den Nucleotidseqenzen der oben erwähnten Gene offensichtlich sowohl Produktionsrate als auch Stabilität der mRNA beeinflußen. Somit entstehen signifikante Unterschiede in mRNA Gehalt und Ausbeute der exprimierten -Galactosidasen. Bei der Expressionssoptimierung von L. plantarum WCFS1 (transformiert mit pSip409, lacLM aus L. reuteri enthaltend), wurden Parameter wie Zuckergehalt im Medium, Temperatur, Induction oder pH variert. Auf dieser Weise konnte die Ausbeute der Enzymproduktion um das 4 bis 5 fache erhöht werden. Um eine antibiotikafreie Kultivierung von Lactobacillus zu ermöglichen, wurde der Erythromycin Resistenz-Marker (erm) aus dem Vektor pSip gegen das Alanin-Racemase Gen (alr) aus L. plantarum ausgetauscht. Diese neuen Vektoren wurden für die Überexpression von ß-Galactosidasen aus L. reuteri L103 und L. plantarum WCFS1 in eine (alr-negative) L. plantarum WCFS1 Mutante eingesetzt. Dadurch wurde ein neues Expressionssystem entwickelt, dessen Expressionsrate mit jener des konventionellen Expressionssystem (mit Erythromycin-Resistenz) vergleichbar war. Das neue Konstrukt ist somit gegeignet für die Produktion von Nahrungsmittelbestandteilen und Lebensmittelsatzstoffen.