Structural characterization of the β-galactosidase from Kluyveromyces lactis" and expression and directed evolution of β-galactosidases with high biotechnological interest"
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Media type:
E-Book
Title:
Structural characterization of the β-galactosidase from Kluyveromyces lactis" and expression and directed evolution of β-galactosidases with high biotechnological interest"
imprint:
[Erscheinungsort nicht ermittelbar]: [Verlag nicht ermittelbar], 2012
Language:
English
Identifier:
Origination:
University thesis:
Dissertation, 2012
Footnote:
Description:
[Abstract] ß-galactosidases are hydrolase enzymes that catalyze the hydrolysis of ß-galactosides into their monosaccharides. Due to this ability these proteins are very important in food, clinical and pharmaceutical industries. In this thesis the Kluyveromyces lactis ß-galactosidase was cloned in a Saccharomyces cerevisiae strain, expressed, purified, and crystallized. Its free state structure and its complex with the product galactose were determined to 2.75 and 2.8 Å, respectively. K. lactis ß-galactosidase folds into 5 domains in a pattern conserved with other prokaryote enzymes solved for GH2 family, although two long insertions in domains 2 (264-274) and 3 (420-443) are unique and seem related to oligomerization and specificity. K. lactis ß-galactosidase tetramer is an assembly of dimers, with higher dissociation energy for the dimers than for its assembly, which can explain that equilibrium exists in solution between the dimeric and tetrameric form of the enzyme. On the other hand, a hybrid K. lactis-Aspergillus niger ß-galactosidase was constructed, expressed and characterized. The hybrid protein between K. lactis and A. niger ß-galactosidases increases the yield of the protein released to the growth medium and the modifications introduced in the construction conferred to the protein biochemical characteristics of biotechnological interest. The production of this hybrid K. lactis - A. niger ß-galactosidase was also tested in a continuous immobilized culture using spent grains (a by-product of brewery industry) as an immobilizing material in an airlift fermenter. Finally, different A. niger ß-galactosidase constructions were expressed and studied in a S. cerevisiae strain and directed evolution techniques were applied to modify the optimal pH of the protein to a more neutral one. ; [Resumen] Las ß-galactosidasas son enzimas hidrolasas que catalizan la hidrólisis de ?-galactósidos en sus monosacáridos correspondientes. Debido a esta capacidad, estas proteínas son muy importantes en las industrias alimentaria, farmacéutica y clínica. En esta tesis, la ß-galactosidasa de K. lactis fue clonada en una cepa de Saccharomyces cerevisiae, expresada, purificada y cristalizada. Su estructura en estado libre y la su complejo con el producto galactosa fueron determinadas a 2,75 y 2,8 Å, respectivamente. La ß- galactosidasa de K. lactis está organizada en 5 dominios en un patrón que está conservado en otras enzimas procariotas de la familia GH2, aunque presenta dos inserciones largas en los dominios 2 (264-274) y 3 (420-443) que son únicas y parecen estar relacionadas con su oligomerización y especificidad. El tetrámero de la ß-galactosidasa de K. lactis está formado por un par de dímeros, presentando una mayor energía de disociación la forma de dímero que su forma tetramérica, lo que puede explicar el por qué existe un equilibrio en solución entre la forma dimérica y tetramérica de la enzima. Por otro lado, se ha construido, expresado y caracterizado una ß-galactosidasa híbrida entre las ß-galactosidasas de K. lactis - Aspergillus niger. La proteína híbrida entre las ß-galactosidasas de K. lactis - A. niger aumenta el rendimiento de la proteína secretada al medio y las modificaciones introducidas en la construcción le han conferido características bioquímicas de interés biotecnológico. Se estudió además la producción de esta proteína híbrida en un cultivo continuo inmovilizado utilizando spent grains" (un subproducto de la industria cervecera) como material de inmovilización en un fermentador tipo "Airlift". Finalmente, se estudió la expresión y producción de la ß-galactosidasa de A. niger en una cepa de S. cerevisiae, y se usaron técnicas de evolución dirigida para modificar el pH óptimo de la proteína hacia un pH más neutro.