University thesis:
Dissertation, Friedrich-Schiller-Universität Jena, 2022
Footnote:
Kumulative Dissertation, enthält einen Zeitschriftenaufsatz
Tag der Verteidigung: 06.09.2022
Zeitschriftenaufsatz in englischer Sprache
Description:
Das Verständnis der komplexen Mechanismen der menschlichen Transkriptionsregulation bleibt trotz vollständiger Sequenzierung des Genoms eine große Herausforderung. Zur Erforschung wichtiger nicht kodierender DNA-Elemente stehen heute mehrere molekulargenetische Werkzeuge zur Verfügung. Unter Verwendung eines modifizierten Cas9-Komplexes entwickelten wir einen kombinierten experimentellen und modellierenden Ansatz zur Untersuchung cis-regulatorischer Interaktionen im nativen genomischen Kontext. Mit Hilfe einer katalytisch aktiven Cas9 haben wir das native humane Renin-Gen mit einem Firefly-Luziferase-kodierenden Gen stabil markiert, sodass die potenzielle Induktion der Genexpression durch ein optisches Signal messbar wurde. Für die anschließende experimentelle Arbeit fand eine modifizierte Cas9 Anwendung. Diese katalytisch inaktive Variante rekrutiert einen Komplex aus Transkriptionsfaktoren (SAM-Komplex), durch den die Expression eines gewünschten Zielgens induziert wird. Durch fünf designte Guide-RNAs konnten wir diesen SAM-Komplex zu spezifischen Promotorregionen des humanen Renins leiten. Die programmierten SAM-Komplexe induzierten in unseren Zellen die Aktivierung von Renin. Die resultierenden Genexpressionen wurden gemessen und in Computermodellen ausgewertet. Durch die Anwendung unseres kombinierten experimentellen und modellierenden Ansatzes können wir zeigen, dass relevante Interaktionen innerhalb der ausgewählten Sequenzen der proximalen Renin-Promotorregion auftreten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass mit Hilfe von Weiterentwicklungen moderner molekulargenetischer Verfahren wie des Cas9-Systems und einem kombinatorischen, experimentellen und modellierenden Setup, eine suffiziente Promotorforschung im endogenen Kontext möglich wird.