Simon, Andreas H.
[Author]
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Bordusa, Frank
[Degree supervisor];
Tittmann, Kai
[Degree supervisor];
Golbik, Ralph
[Degree supervisor]Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
"Screening und Charakterisierung D-Aminosäure-spezifischer hydrolytischer Enzyme"
University thesis:
Dissertation, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, 2022
Footnote:
Tag der Verteidigung: 06.05.2022
Description:
Im Konzept der Substratmimetika-assistierten Semisynthese von all-L-Peptiden und all-L-Proteinen besitzen D-Aminosäure-spezifische Peptidasen aufgrund der ausbleibenden Sekun-därhydrolyse ihrer Reaktionsprodukte ein hohes biotechnologisches Potential. Allein die Verfüg-barkeit dieser Peptidasen limitiert hierbei ihre Anwendung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Screening-System auf Basis des intern gequenchten fluorogenen Substrats Abz-D-Arg-D-Ala-pNA entwickelt und etabliert. Es wurde genutzt, um zum einen im Organismus B. thuringiensis und zum anderen in einem evolutiven Ansatz zur Konversion der Stereospezifität von Trypsin nach D-Aminosäure-spezifischen Enzymspezies zu screenen. Die so gewonnen putativ D-stereospezifischen Peptidasen und -varianten wurden folgend mittels einer Aminosäuremethylesterbibliothek bzw. einer Pentapeptidbibliothek hinsichtlich ihrer Spezifität und ihres synthetischen Potentials charakterisiert. Darüber hinaus konnte die Struktur der D-Arginin-spezifischen D-stereospezifischen Hydrolase aus B. thuringiensis gelöst werden.
Within the concept of substrate mimetic-assisted semisynthesis of all-L-peptides and all-L-proteins, D-amino acid-specific peptidases have a high biotechnological potential due to the non-existing secondary hydrolysis of the products. However, the availability of these peptidases limits their application. In the present work, a screening system based on the internally quenched fluorogenic substrate Abz-D-Arg-D-Ala-pNA was developed and subsequently used to screen d-amino acid-specific enzyme species in the organism B. thuringiensis as well as in an evolutionary approach for the conversion of the stereospecificity of trypsin. The putative D-stereospecific peptidases and variants thus obtained were then characterized for their specificity and synthetic potential using an amino acid methyl ester library and a pentapeptide library, respectively. Furthermore, the structure of the D-arginine-specific D-stereospecific hydrolase from B. thuringiensis was solved.