Durchflusszytometrische Bestimmungen von probiotischen Starterkulturen unter besonderer Berücksichtigung von Laktobazillen und Bifidobakterien

Media type: E-Book; Thesis

Title: Durchflusszytometrische Bestimmungen von probiotischen Starterkulturen unter besonderer Berücksichtigung von Laktobazillen und Bifidobakterien

Contributor: Ahlfeld, Birte [Other]

imprint: Gießen: DVG Service, 2008

Extent: Online-Ressource (II, 192 S.=894 kb, text); graph. Darst

Language: German

Identifier:

Keywords: Probiotikum > Starterkultur > Lactobacillus > Bifidobacterium > Durchflusscytometrie > Keimzahl

Origination:

University thesis: Zugl.: Hannover, Tierärztl. Hochsch., Inst. für Lebensmittelqualität und -sicherheit, Diss., 2008

Footnote:

Description: Probiotika, Bifidobakterien, Laktobazillen. - Probiotische Produkte erfreuen sich weltweit zunehmender Beliebtheit. Mikroorganismen, die eine gesundheitsbezogene Wirkungskomponente besitzen, stellen hierbei den wertbestimmenden Anteil dar und sind von großer wirtschaftlicher Bedeutung. Als Voraussetzung für einen physiologischen probiotischen Effekt gilt ein Gehalt von 106 KbE/g Produkt. Die Keimzahlbestimmung probiotischer Bakterien aus Milchprodukten erfolgt bisher kulturell auf Elektiv- und/oder Selektivnährböden. Es existiert aber bislang keine Standardmethode. Da die kulturelle Methode außerdem zeitaufwendig ist, sind Schnellmethoden zur quantitativen Bestimmung wünschenswert. In diese Arbeit wurden daher 10 Stämme der Gattung Lactobacillus (L.), 7 der Gattung Bifidobacterium (B.), ein Stamm der Spezies Escherichia (E.) coli sowie Kulturen aus 10 Milchmischerzeugnissen und 3 pharmazeutischen Präparaten (zwei Monokulturen mit E. coli, eine Mischkultur mit L. paracasei, L. acidophilus, Bifidobacterium spp., Lactococcus lactis) einbezogen. Reinkulturen wurden entweder in Bouillon pur oder in Bouillon mit 25 % Milch (0,3 % und 3,5 % Fett) eingemischt und ebenso wie ein Teil der Milcherzeugnisse bei 4 °C für 42 Tage gelagert und an Tag 1, Tag 21 und Tag 42 untersucht. Die Pharmazeutika wurden 5 mal im monatlichen Intervall untersucht. Die Untersuchungen fanden parallel im Durchflusszytometer (FACSCalibur®, Becton Dickin-son) mithilfe der Fluoreszenzfarbstoffe SYTO®9 (Lebend- und Totfarbstoff), TO-PRO®-3 und PJ (Totfarbstoffe) sowie mittels Oberflächenspatelverfahren (OSV) auf verschiedenen Elektiv- bzw. Selektivnährböden (MRS, MRS-V, MUP, X-Glu, RCM, M-17, PC) statt. Zur Quantifizierung erfolgte im FACS die Zugabe einer bekannten Anzahl Beads (PeakFlow™ Orange flow cytometry reference beads 2,5 µm, 1,2 x 108) in bekanntem Volumen, wodurch rechnerisch der Gehalt der untersuchten Bakterien ermittelt werden konnte. Im Laufe der 42tägigen Lagerung wurde die bakterielle Vitalität von Reinkulturen und Produkten mit dem Durchflusszytometer bestimmt und mit den Änderungen der Keimzahlen des kulturellen Verfahrens verglichen. Die Fluoreszenzfarbstoffe ermöglichten die Unterscheidung von vitalen und toten Bakterien sowie eine prozentuale Bestimmung dieser Parameter. Danach wurde die Quantifizierung im FACS mithilfe von Beads (Dreifachansatz) etabliert. Zur Festlegung der Nachweisgrenze erfolgten Untersuchungen von Reinkulturen und einem Produkt mit Monokultur. Während des 42tägigen Lagerungsversuches wurde eine Keimzahlbestimmung von Reinkulturen mit und ohne Milchzusatz sowie Milchmischerzeugnissen durchgeführt. Die gewonnenen Werte wurden stets mit den mittels OSV (Doppelansatz) ermittelten Keimzahlen verglichen. Bei der Untersuchung der 12 Reinkulturen nahm die mittels OSV bestimmte Keimzahl ab, während parallel der Anteil toter Bakterien im FACS zunahm. 9 Stämme wie z.B. L. casei (S - 16) und B. animalis (S-4) zeigten relativ gleichbleibende Anteile bzw. eine geringe Abnahme vitaler Bakterien und Keimzahlen (Abnahme vitaler Bakterien 2,7-23 %, |∆ KZ| = 0,02-1,51 lg KbE/ml). 3 Stämme wie z.B. L. johnsonii (S-14) und B. longum (S-7) zeigten einen sehr großen Vitalitäts- und Keimzahlverlust (Abnahme vitaler Bakterien 67,3-79,7%, |∆ KZ| = 3,68-8,08 lg KbE/ml). Bei der Untersuchung der Milchmischprodukte konnte im OSV gezeigt werden, dass die im Produkt eingesetzten Stämme von L. casei, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium sp. und S. thermophilus während der Lagerung sehr stabil blieben (|∆ KZ| ≤ 0,7 lg KbE/ml). Anders verhielt sich L. acidophilus, welcher stets eine große Abnahme der Keimzahl aufwies, wenn auch teilweise erst nach Ablauf des MHD. Im FACS war eine Zuordnung der Bakterienwolken nur präsumtiv möglich. Die Vitalität für Präparate mit Monokultur von E. coli ließ sich gut darstellen. Wie für die Reinkulturen ermittelt zeigte sich parallel zum Vitalitätsverlust eine Abnahme der Keimzahlen. Am MHD ließen sich im OSV mindestens 8,2 lg KbE/ml nachweisen. Im pulverförmigen Produkt mit einer Mischkultur von Laktobazillen, Bifidobakterien und Laktokokken ließ sich zwar im FACS die Vitalität der Bakterienwolken ermitteln, allerdings konnte wie bei den Milcherzeugnissen nur eine präsumtive Zuordnung zu den eingesetzten Stämmen erfolgen. Bei der Ermittlung der Nachweisgrenze nahmen die mittels OSV bestimmten Keimzahlen parallel zu den Verdünnungsstufen ca. 1 lg KbE/ml ab, während die im FACS gewonnenen Keimzahlen nach anfangs gleicher Entwicklung bei etwa 105 KbE/ml stagnierten. Somit betrug die Nachweisgrenze der Keimzahlbestimmung im FACS 105 KbE/ml. Die Keimzahlen für Reinkulturen mit Milchzusatz wiesen im FACS und OSV anfangs gleiche Keimgehalte auf. Allerdings waren im Laufe der 42tägigen Lagerung im FACS teilweise signifikant höhere Keimzahlen messbar als im OSV. In den Proben mit Milchzusatz waren häufig signifikant höhere Keimzahlen messbar als ohne Milchzusatz. Milchmischerzeugnisse mit Monokulturen lieferten mittels beider Methoden vergleichbare Ergebnisse, während sich wie schon bei der Vitalitätsbestimmung festgestellt die Zuordnung und Abgrenzung der Bakterienwolken für Mischkulturen im FACS nur präsumtiv vornehmen ließ. Für Messungen von Reinkulturen sowohl zur Qualifizierung als auch zur Quantifizierung erwies sich das Durchflusszytometer als geeignet. Die Nachweisgrenze von ca. 105 KbE/g lag unter dem geforderten Mindestgehalt probiotischer Bakterien von 106 KbE/g, so dass das Durchflusszytometer für quantitative Bestimmungen von probiotischen Produkten geeignet erschien. Die Höhe der Nachweisgrenze stimmte mit den Erkenntnissen anderer Arbeiten überein. Im Lagerungsverlauf wurden im FACS teilweise höhere Werte als im OSV bestimmt. Ursächlich könnten im Durchflusszytometer quantifizierbare, lebende, wenn auch nicht mehr vermehrungsfähiger Bakterien sein, die mit dem kulturellen Verfahren nicht mehr nachweisbar waren. Qualitätskontrollen wurden bisher mittels kultureller Verfahren durchgeführt und können – gerade nach Lagerung - nicht sicher alle vitalen, gestressten Bakterien durch Wachstum erfassen. Der alternative Einsatz eines Durchflusszytometers würde die gleichzeitige Erfassung von Vitalität und Keimzahl der Bakterien innerhalb kurzer Zeit erlauben. Milch schien einen protektiven Effekt auf die Lagerungsstabilität zu haben. Allerdings konnte gezeigt werden, dass bei Milchzusatz höhere Fettgehalte die Auswertung am FACS erschwerten, während bei einem mäßigen Fettanteil – wie bei der Mehrzahl probiotischer Produkte gegeben - gute Ergebnisse zu erzielen waren. Bei der Untersuchung von Milchprodukten mit Mischkulturen verhinderten überlappende Bakterienwolken eine sichere Zuordnung der im FACS gemessenen Bakterien. Hier wären für eine Zuordnung der Bakterien spezielle Marker wie z.B. Antikörper und Gensonden oder der Einsatz der Sortierfunktion am FACS wünschenswert. Zur Vitalitäts- und Keimzahlbestimmung von Bakterien aus Rein- und Monokulturen scheint die Durchflusszytometrie mit einer Nachweisgrenze von ca. 105 KbE/g geeignet. Im FACS lassen sich zusätzlich vitale, obgleich nicht mehr vermehrungsfähige Bakterien darstellen, die durchaus noch probiotisch wirksam sein könnten. Bei einer weiteren Produktgruppe, den Milchprodukten mit Mischkulturen, sind gegebenenfalls zusätzlich Techniken zur Speziesidentifizierung im FACS erforderlich.

Access State: Open Access

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