University thesis:
Zugl.: Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss., 2009
Footnote:
Description:
TgMyoA, Baculovirus, Strukturmodellierung. - Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer einzelliger Parasit, der zur Replikation in eine Wirtszelle eindringen muß. Dies geschieht über die gleitende Bewegung, welche von einem Aktin-Myosin-Komplex angetrieben wird. Das Myosin A (TgMyoA) spielt hierbei eine entscheidende Rolle. Es bildet zusammen mit einer assoziierten leichten Kette (TgMLC1) und zwei gliding associated-Proteinen (GAP45 und GAP50) das Glidosom. Das GAP50 sorgt für die starre Verankerung des Glidosoms am Inneren Membran-Komplex (IMC) des Parasiten. Aktin wird über Aldolasen und einen Transmembranrezeptor an der Wirtszellmembran verankert. Dies bildet die Grundlage des capping-Modells, bei der sich die Wirtszellmembran über den Parasiten stülpt. Die Replikation findet so in einer parasitophoren Vakuole statt. TgMyoA ist somit essentiell für das Überleben des Parasiten und ein guter Angriffspunkt für spezifische Therapeutika. Bislang war es jedoch nicht möglich das Myosin A aus Toxoplasma gondii in großen Mengen zu exprimieren. Es konnten nur geringe Mengen Protein unter großem Aufwand in Toxoplasma gondii selbst exprimiert werden. Bisherige kinetische Untersuchungen zeigten, dass sich TgMyoA zum Plus-Ende des Aktinfilamentes bewegt. Mit einer Motilität von 5,2 µm/s und einer Schrittweite von 5,3 nm hat es vergleichbare Eigenschaften wie schnelles Muskelmyosin II. Damit das Protein aufgereinigt, das Myosin kristallisiert und spezifische Inhibitoren gefunden werden können, war es essentiell, möglichst große Mengen Protein zu exprimieren. Dies sollte mit dem Baculovirus-Expressionssystem geschehen, da hiermit Proteine in großen Mengen unter geringem Aufwand exprimiert werden können. In den Ovarzellen des Nachtfalters Spodoptera frugiperda konnte keine Expression erzielt werden. Diese gelang erst am Ende meiner Arbeit in den Ovarzellen des Nachtfalters Trichoplusia ni. Die erfolgreiche Expression stellt eine wichtige Grundlage für die weitere Forschung dar. Da noch keine ausreichenden Mengen für eine Kristallisation des Proteins bereitstanden, wurde mit Hilfe des Computerprogramms MODELLER durch Homologiemodellierung zum Jakobsmuschelmyosin sowie der schon vorhanden Struktur der Schwanzdomäne des Myosins A aus Plasmodium falciparum ein Modell des TgMyoA erstellt. Um die Interaktion mit der leichten Kette zu demonstrieren wurde die leichte Kette mit Hilfe des bekannten Plasmodium falciparum Myosin A-tail interacting protein (PfMTIP) modelliert. In Anlehnung an dem bekannten Plasmodium falciparum Myosin A-PfMTIP-Komplex wurde ein Docking der beiden Strukturen durchgeführt, bei dem das TgMyoA mit der leichten Kette in Verbindung gebracht wurde. So konnten diejenigen Aminosäuren, welche wichtig für die Interaktion der leichten mit der schweren Kette des Myosins A sind, dargestellt werden. Diese interagierenden Aminosäuren sind sehr charakteristisch für den TgMyoA-TgMLC1-Komplex und stellen somit einen weiteren sehr spezifischen Angriffspunkt für Inhibitoren dar. Mit diesen Modellen können spezifische Inhibitoren in silico auf eine mögliche Bindung getestet werden und so unter der Vielzahl von Strukturen jene herausgefiltert werden, die eine gute Anpassung zeigen bzw. nicht passende ausgegrenzt werden. Dies gibt einem für in vitro Tests sehr wertvolle Anhaltspunkte und eine überschaubare Anzahl an Inhibitoren, die getestet werden müssen.