University thesis:
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Insti. für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik, Diss., 2014
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Description:
FTIR, Proteinsekundärstruktur, Bruteier. - Das Ei ist eine abgeschlossene Zelle außerhalb des maternalen Organismus, aus der sich ohne die Zugabe anderer Stoffe von außen, nur durch Wärme, Gasaustausch und gelegentliche Rotationen ein vollständig neues Lebewesen, das Küken, entwickelt. Folglich müssen im Verlauf der Bebrütung qualitative und quantitative Veränderungen im Eigelb, seinen Fraktionen, den individuellen Proteinen und dem Eiklar stattfinden, um dieses neue Lebewesen zu erschaffen. Obwohl bereits viele biologische und chemische Mechanismen, die während der Bebrütung ablaufen, aufgeklärt werden konnten, ist bis heute wenig über Proteinveränderungen des verbleibenden Eigelbs auf molekularer Ebene während der frühen Phase der embryonalen Entwicklung bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, erstmalig die bebrütungsinduzierten Veränderungen der Sekundärstruktur von Eigelb, seinen drei Hauptfraktionen (Granula, Plasma, LDL), den assoziierten Proteinen und Eiklar während der frühen Phase der aviären Embryonalentwicklung zu untersuchen. In diesem Zusammenhang sollte betont werden, dass sich diese Arbeit mit den Veränderungen der Proteine auf molekularer Ebene befasst und nicht mit der Embryogenese an sich. Die Überprüfung der mutmaßlich auftretenden Proteinveränderungen fand mittels einer Kombination aus FTIR-Technik, konventioneller IEF-Methode und HPLC-Messungen statt. Diesbezüglich wurden zwei Faktoren ausgewertet, die potentiell mit Veränderungen der Proteinsekundärstruktur von Eigelb verknüpft sein könnten. Zuerst wurde der Eigelb pH-Wert von Bruteiern während einer acht tägigen Inkubationszeit bestimmt und mit dem Eigelb pH-Wert von Nativeiern verglichen, die gleichermaßen bebrütet wurden. Im Anschluss wurde ein möglicher Effekt der Eisenfreisetzung aus Phosvitin, einem wichtigen Eigelbprotein, untersucht. Phosvitin wird in diesem Zusammenhang eine bedeutende Rolle während der Hämatopoese des sich entwickelnden Kükens als Eisenträger (Fe3+) des Eigelbs zugeschrieben. Im Folgenden wurden Eigelb, seine Hauptfraktionen und Eiklar im Verlauf der frühen Bebrütung mittels FTIR-Messungen analysiert. Zur begleitenden Bestätigung der FTIR-Ergebnisse wurden die bebrüteten Eigelbproben mittels IEF-Technik untersucht sowie die FTIR-Ergebnisse der bebrüteten Eiklarproben mittels HPLC-Messungen überprüft. Die Auswertung der pH-Wertmessungen sowie die Eisenfreisetzung aus Phosvitin ergaben, dass weder der signifikante Anstieg des Eigelb-pH-Wertes der Bruteier (von 6,07 auf 6,92), noch die signifikante Eisenfreisetzung aus Phosvitin (von 1,98 ± 0,06 µg/mg auf 0,11 ± 0,03 µg/mg) direkt mit den Veränderungen der Proteinsekundärstruktur von Eigelb und seinen Fraktionen in Verbindung gebracht werden können. Die FTIR-Messungen zeigten, dass die Proteinkonformationen der Voll-Eigelbproben, der Granula- und LDL-Fraktion sowie der Eiklarproben im Verlauf der Bebrütung stabil blieben. Demgegenüber offenbarte die separate Untersuchung der Plasmafraktion signifikante Veränderungen der Proteinsekundärstruktur an Tag 3 und Tag 4 der Bebrütung (p ≤ 0,0001) gegenüber den übrigen Bruttagen (Tag 0, 5 und 8). Es wird jedoch als unwahrscheinlich erachtet, dass diese Veränderungen durch Sekundärstrukturänderungen der ursprünglich im Plasma vorkommenden Proteine hervorgerufen wurden. Vielmehr wird dem physiologischen Influx von Eiklar in den Dottersack im Verlauf der Bebrütung eine wichtige Rolle bei der Proteinmodifikation von Eigelb zugeschrieben. Diese Modifikationen, die mittels FTIR-Messungen ermittelt werden konnten, wurden darüber hinaus durch IEF-Untersuchungen der wasserlöslichen Eigelbproteine, sowie ausgewählter Eiklarproteine (Ovalbumin, Ovotransferrin, Lysozym) bestätigt. Dabei konnten keine zusätzlichen Proteinbanden im Brutverlauf detektiert werden, die auf die Entstehung neuer Proteine hinwiesen. Als unterstützende Methode zeigten die HPLC-Messungen der Eiklarproben der Bruteier in Übereinstimmung mit den IEF-Ergebnissen, dass im Verlauf der Bebrütung keine neuen Peaks in den Chromatogrammen auftauchten. Die Eiklarproteine Ovalbumin, Ovotransferrin und ...