Novel serological and molecular assays for Crimean‑Congo hemorrhagic fever virus infections and their application in prevalence studies on sub‑Saharan African countries

Media type: E-Book; Thesis

Title: Novel serological and molecular assays for Crimean‑Congo hemorrhagic fever virus infections and their application in prevalence studies on sub‑Saharan African countries

Contributor: Sas, Miriam Andrada [Author]; Groschup, Martin H. [Degree supervisor]

Published: Hannover: Tierärztliche Hochschule Hannover, 2017

Extent: 1 Online-Ressource (129 Seiten, 2.745 KB)

Language: English

Identifier:

Keywords: Subsaharisches Afrika > Krim-Kongo-Fieber > Immunoscreening > Serodiagnostik > Indikatororganismus > Wiederkäuer

Origination:

University thesis: Dissertation, Tierärztliche Hochschule Hannover, 2017

Footnote: Zusammenfassungen in deutscher und englischer Sprache

Description: Krim-Kongo Hämorrhagisches Fieber (CCHF) ist eine beim Menschen tödlich verlaufende Erkrankung mit Letalitätsraten von 5% (Türkei) bis 80% (Volksrepublik China). Diese Variation hängt vom Kenntnisstand in der Bevölkerung über das Vorkommen dieser Infektionskrankheit, von der Qualität des Gesundheitswesens, von der Genauigkeit des Meldesystems und vom zirkulierenden Virusstamm ab. Das Krim-Kongo-Hämorrhagische‑Fieber-Virus (CCHFV) wird vorrangig durch Zecken der Gattung Hyalomma übertragen und kommt in Afrika, Asien und Europa vor. Hyalomma spp. bevorzugen im Allgemeinen ein warmes und trockenes Klima und eine weniger dichte Vegetation. Hyalomma spp.-Populationen kommen deshalb natürlicherweise nur bis zum 46. nördlichen Breitengrad vor. Weitere Infektionsquellen für den Menschen sind der Kontakt zu Blut, Körperflüssigkeiten und Gewebematerial von virämischen Tieren oder auch infektiösen Menschen; auch das Zerdrücken von CCHFV-infizierten Zecken kann zur Infektion führen. Obwohl Tiere in der Regel nach der Infektion keine klinischen Symptome zeigen, entwickeln sie einen stabilen Antikörpertiter, der noch viele Jahre nach der Infektion nachweisbar ist. Deshalb kann der CCHFV-Antikörpernachweis bei Wiederkäuern zur Feststellung von Risikogebieten verwendet werden. Am gründlichsten ist die CCHFV-Infektion in endemischen Gebieten in Europa und Kleinasien untersucht worden. Demgegenüber gibt es über das CCHFV-Vorkommen in Afrika kaum aktuelle Daten. Daher war das Hauptziel der hier vorgestellten Studien, das CCHFV-Vorkommen in verschiedenen Subsahara-Ländern (Mauretanien, Mali, Kamerun und Demokratische Republik Kongo (DR Kongo)) zu untersuchen. Hierzu wurden zunächst modifizierte serologische Tests angewendet, die zuvor zur Untersuchung von Wiederkäuerseren aus Südosteuropa entwickelt worden waren. Diese Testmethoden umfassten einen kommerziellen (Spezies-adaptierten) Enzym-gekoppelten-Immunadsorptionstest (ELISA) und einen im eigenen Labor entwickelten indirekten CCHFV‑IgG-ELISA sowie einen (Spezies-adaptierten) indirekten Immunfluoreszenz-Test (IFA). Die Anpassung dieser Tests umfasste Veränderungen in den Protokollen und bei den Grenzwerten. Die so modifizierten Tests erreichten diagnostische Sensitivitäten von 95% ‑ 98% und Spezifitäten von 98% - 100%. Da diese Tests jedoch auch in weniger gut ausgestatteten Laboren in Afrika bei tropischer Hitze verwendet werden sollten, wurde ein weiterer auch unter diesen Verhältnissen noch robuster indirekter CCHFV-IgG-ELISA für Rinder mit vergleichbarer diagnostischer Performance (Sensitivität und Spezifität jeweils 99%) entwickelt. Dieser ELISA wurde anschließend im Rahmen seroepidemiologischer Studien an Rinderseren aus Mali und Kamerun (2014 gesammelt) eingesetzt. Parallel dazu wurde ein hochsensitiver Multiplex-CCHFV-RT-qPCR-Nachweis auf der Basis von 12 Genotyp-spezifischen und 2 universalen Primern entwickelt und validiert, der darauf abzielt alle aktuell bekannten CCHFV-Stämme zu detektieren. Dieser RT-qPCR-Nachweis wurde komplettiert durch die Verwendung zweier spezifischer Carboxyfluorescein-Sonden zum direkten CCHFV-Erregergenom-Nachweis. Ein solcher universeller Nachweis war bis dato angesichts der großen Sequenz-Variationen zwischen den CCHFV-Stämmen der sechs bekannten Genotypen nicht verfügbar. Mithilfe von sechs Kalibrator-RNAs ist ferner die genaue Genotyp-spezifische Quantifizierung von CCHFV möglich. Die serologische Nachweismethoden wurden anschließend zur Untersuchung von über 3000 Wiederkäuerseren aus den in Subsahara-Afrika liegenden Ländern Mauretanien, Mali, Kamerun und DR Kongo verwendet. Wiederkäuerseren wurden als CCHFV-Antikörper-positiv erachtet, wenn sie in zwei unabhängigen ELISA-Systemen reaktive Ergebnisse erbrachten. Bei abweichenden Ergebnissen wurde eine IFA zur endgültigen Diagnose durchgeführt. Die Untersuchungen zeigen, dass CCHFV-Infektionen in allen vier Ländern (Mauretanien, Mali, Kamerun und DR Kongo) vorkommen. Dies war insbesondere für Kamerun ein überraschendes Ergebnis, da es sich um den ersten Nachweis dieser Infektionskrankheit in diesem Land handelt. Die höchsten Prävalenzraten wurden in Mauretanien, Mali und Nordkamerun nachgewiesen. Dies stimmte mit den Vegetations- und klimatischen Bedingungen und den dort jeweils vorliegenden, von Hyalomma-Zecken präferierten Habitaten überein. Umgekehrt lassen sich auch die deutlich niedrigeren Prävalenzen in Südkamerun und DR Kongo mit der (geringeren) Eignung der lokalen Vegetation und des lokalen Klimas für Hyalomma-Zecken erklären. Ggfs. steht auch die Viehdichte mit dem Vorkommen von CCHFV in einem Gebiet im direkten Zusammenhang. In Nordkamerun, wo eine deutlich höhere Viehdichte als im Süden des Landes vorzufinden ist, wurden deutlich mehr Rinder positiv auf CCHFV-spezifische Antikörper getestet als im Süden mit geringerer Rinderdichte. Eine ähnliche Korrelation wurde auch in Mali nachgewiesen. Da im Rahmen dieser Studie zum ersten Mal CCHFV-Infektionen in Kamerun detektiert werden konnten, war es wichtig, das Virus auch direkt nachzuweisen. Zu diesem Zweck wurden in einem CCHFV-hochendemischen Gebiet in Nordkamerun 109 Hyalomma-Zecken von Rindern abgesammelt und molekulardiagnostisch auf CCHFV untersucht. Hierzu wurde die hochsensitive Multiplex-SYBR–Green-CCHFV-RT-qPCR verwendet. Proben mit charakteristischer Amplifikation wurden mithilfe der Sonden-basierten Multiplex-CCHFV-RT-qPCR bestätigt. CCHFV konnte in 7 von 109 Zecken nachgewiesen werden, und die amplifizierte Genomsequenz konnte phylogenetisch als Genotyp III eingeordnet werden. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass Wiederkäuer auch in den Subsahara‑Ländern als ausgezeichnete Indikator-Tiere für CCHFV-Infektionen angesehen werden können und dass hierzu nun hochsensitive und -spezifische und gleichzeitig robuste ELISAs zur Verfügung stehen. Die hohe Seroprävalenz in Nordkamerun wurde durch den molekularen RT-qPCR-Nachweis des CCHFV-Genoms bestätigt. Die serologischen und molekulardiagnostischen Daten deuten auf ein weiträumiges und gleichzeitig hochgradiges Infektionsgeschehen in den Ländern Subsahara-Afrikas hin. Angesichts der vorliegenden Daten erscheint zumindest in bestimmten Regionen die Einführung von Aufklärungsaktionen für potenzielle Risikogruppen und auch der Allgemeinbevölkerung empfehlenswert.

Access State: Open Access

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