Steigerung der Kältetoleranz von Eberspermatozoen durch Modifikationen im Prozessablauf der Tiefgefrierkonservierung

Media type: E-Book; Thesis

Title: Steigerung der Kältetoleranz von Eberspermatozoen durch Modifikationen im Prozessablauf der Tiefgefrierkonservierung

Contributor: Schäfer, Jana [VerfasserIn]; Waberski, Dagmar [AkademischeR BetreuerIn]; Schulze, Martin [AkademischeR BetreuerIn]

imprint: Hannover: Tierärztliche Hochschule Hannover, 2017

Extent: 1 Online-Ressource (V, 141 Seiten, 2.703 KB)

Language: German

Identifier:

Keywords: Kälteresistenz > Kryokonservierung > Spermium > Eber

Origination:

University thesis: Dissertation, Tierärztliche Hochschule Hannover, 2017

Footnote: Zusammenfassungen in deutscher und englischer Sprache

Description: Die Kältesensibilität von Eberspermatozoen stellt ein grundlegendes Problem für die Kryokonservierung von Sperma dieser Tierart dar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, über die Modifikation ausgewählter Verarbeitungsprozesse bei der Tiefgefrierkonservierung von dezentral gewonnenem und über Nacht zum Labor transportiertem Ebersperma eine erhöhte Kältetoleranz und somit eine bessere Qualität aufgetauter Eberspermatozoen zu erreichen. Insgesamt wurden vier modular aufeinander aufbauende Versuche durchgeführt. Die Ergebnisse eines Versuches wurden jeweils in den Ablauf der Folgeversuche implementiert. So konnte eine kontinuierliche Optimierung des Verfahrens vorgenommen werden. Alle Ejakulate wurden auf derselben Eberstation gewonnen, 1+1 (v/v) mit Beltsville thawing solution verdünnt und innerhalb von 20 Stunden zum Labor geliefert. Dort erfolgten die Untersuchung der Qualität vorverdünnter Ejakulate, die Tiefgefrierkonservierung im „split sample“-Verfahren und die Qualitätskontrolle aufgetauter Proben. Die Beurteilung der Qualität fand sowohl mikroskopisch als auch mittels CASA (AndroVision®, Minitüb, Deutschland) und Durchflusszytometrie (Accuri C6, BD Biosciences, Belgium) statt. Die Spermienmorphologie wurde bei Probeneingang und die Akrosomintegrität nach dem Auftauen mikroskopisch beurteilt. Die Motilitätsanalyse erfolgte nach 10-minütiger Inkubation bei 38 °C. Zusätzlich wurden bei aufgetauten Proben Messungen nach 30 und 120 Minuten vorgenommen. Die durchflusszytometrische Erfassung der Chromatinstabilität (SCSA), der plasmamembranintakten, mitochondrienaktiven Spermatozoen (PI neg., R123 pos.) sowie der plasmamembran- und akrosomintakten Spermatozoen (FITC-PNA neg., FITC-PSA neg., PI neg.) lieferte zusätzliche Aussagen zur Qualität. Im ersten Versuch wurde die dem 20-stündigen, isothermen Transport angeschlossene Haltezeit bei 17 °C variiert. Es erfolgte ein Vergleich zwischen einer 2-stündigen Haltezeit, welche die Dauer der Eingangsuntersuchung abdeckte und einer 24-stündigen Haltezeit bei 17 °C. Bei Verarbeitung nach 2-stündiger Haltezeit blieben die Auftaumotilität und die Geißelschlagfrequenz signifikant besser erhalten. Die Durchführung des zweiten Versuches sollte Aufschluss über die kryoprotektiven Eigenschaften von Trehalose und Androstar® CryoPlus (Minitüb, Deutschland) im Vergleich zur üblicherweise genutzten 11 %igen Laktoselösung geben. Die Aufbereitung von Androstar® CryoPlus erfolgte nach Herstellerangaben. Trehalose wurde als 300 mM Lösung verwendet. Der Einsatz von Androstar® CryoPlus erbrachte eine signifikant geringere Spermaqualität als das Laktose- und Trehalosemedium. Trehalose und Laktose zeigten mit einer Auftaumotilität von jeweils über 40 % gute kryoprotektive Eigenschaften. Der Anteil plasmamembran- und akrosomintakter Spermatozoen blieb bei Verwendung von Laktose tendenziell höher erhalten als bei Trehalose. Der dritte Versuch diente dem Vergleich einer kurzen (2 und 4 Stunden) und längeren (24 und 48 Stunden) Äquilibrierungsdauer im Kühlverdünner bei 5 °C. Neben anderen Parametern war die Auftaumotilität bei 4-stündiger Äquilibrierung jener nach 2, 24 und 48 Stunden Äquilibrierung überlegen. Im vierten Versuch erfolgte ein Zusatz von Zinksulfat-Heptahydrat zum Kühl-, Gefrier- und Auftauverdünner. Es wurden Verdünnermedien mit jeweils 100 μM, 500 μM oder 1000 μM des Stoffes gegenüber einer zusatzfreien Kontrolle auf ihre kryoprotektive Funktion hin getestet. Die Supplementation mit Zinksulfat-Heptahydrat beeinflusste die Spermaqualität nach dem Auftauen nicht. Schlussfolgernd ermöglichen die dargestellten Modifikationen im Verarbeitungsprozess der Kryokonservierung eine Qualitätssteigerung von tiefgefrierkonserviertem Versandsperma beim Eber. Eine zügige Weiterverarbeitung 2 Stunden nach Ankunft der Proben ist einer zusätzlichen Haltezeit von 24 Stunden bei 17 °C vorzuziehen. Die Äquilibrierungsdauer bei 5 °C sollte auf insgesamt 4 Stunden verlängert werden. Als Basis für Kühl- und Gefrierverdünner erbringt eine 11 %ige Laktoselösung in Kombination mit Eidotter, Glycerol und Orvus ES Paste die besten kryoprotektiven Eigenschaften. Ein Zusatz von Zinksulfat-Heptahydrat ist verzichtbar.

Access State: Open Access

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