University thesis:
Dissertation, Universität Freiburg, 2014
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Description:
Zusammenfassung: Assimilation of nitrogen in the most reduced form as ammonium is an essential biological process for prokaryotes, archaea and plants in a competitive environment. The transport of NH₄⁺ /NH₃ across biological membranes is mediated by a family of ubiquitous integral membrane proteins, the Ammonium transport (Amt) proteins. Although the availability of several crystal structures of members of this family, in combination with functional data that was derived from two-electrode voltage clamp experiments with protein expressed in Xenopus oocytes, in vivo radioactive uptake assays and in vivo pH measurements in proteoliposomes, it was to date not possible to unmistakably identify the transported substrate and to reveal mechanistic details. In this work a reproducible, reliable and controlled in vitro assay was established, using the three homologous Amt proteins from the hyperthermophilic organism Archaeoglobus fulgidus. Therefore, recombinant Af-Amt1-3 were purified and reconstituted in preformed liposomes. The proteoliposomes were analyzed by freeze fracture-transmission electron microscopy and studied with two different electrophysiological techniques. Slow transport rates prevented a functional characterization with Planar Lipid Bilayer (PLB) based electrophysiology, whereas electrophysiology on Solid Supported Membranes (SSM) convincingly provided first reliable in vitro data for Amt proteins. This work unambiguously confirmed electrogenic substrate transport for Af-Amt1 and Af-Amt3 and describes the full characterization of both proteins under pH equilibrium conditions, at zero voltage. SSM measurements reveal functional differences between the proteins regarding the influence of pH, the relative transport rates and the substrate affinity.
Zusammenfassung: Die Stickstoffaufnahme in reduzierter Form, als Ammonium ist innerhalb einer kompetitiven Umwelt ein essenzieller biologischer Prozess vorkommend in Prokaryonten, Archaeen und Pflanzen. Der NH₄⁺ /NH₃-Transport über biologische Membranen wird mittels einer ubiquitären, integralen Membranproteinfamilie gewährleistet, den sogenannten Ammoniumtransportproteinen (Amt-Proteine). Bisher wurden mehrere Kristallstrukturen in Kombination mit funktionellen Daten von Mitgliedern dieser Proteinfamilie erhalten. Die funktionellen Daten wurden mittels Zweielektroden basierten Patch-Clamp Messungen an Xenopus Oozyten, in vivo radioaktiv Messungen und in vivo pH-Messungen in Proteoliposomen erhalten. Dennoch war es bisher nicht möglich das transportierte Substrat, sowie mechanistische Details des Transportprozesses zu ermitteln. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein reproduzierbarer, verlässlicher und kontrollierter in vitro Messaufbau für die drei homologen Amt Proteine des hyperthermophilen Organismus Archaeoglobus fulgidus etabliert. In Folge dessen wurden die drei rekombinant überproduzierten Amt Proteine Af-Amt1-3 aufgereinigt und in bereits vorgeformte Liposomen rekonstituiert. Die Proteoliposomen wurden mittels Gefrierbruch-Transmissionselektronenmikroskopie analysiert und mittels zweier unterschiedlicher elektrophysiologischer Techniken untersucht. Geringe Transportraten verhinderten jedoch eine funktionelle elektrophysiologische Charakterisierung mittels freistehender planarer Lipiddoppelmembran (sog. Planar Lipid Bilayer, PLB), wohingegen Messungen mittels einer festphasenunterstützten Membran (sog. Solid Supported Membrane, SSM) in überzeugender Weise, die ersten verlässlichen in vitro Ergebnisse liefern konnte. Diese Arbeit bestätigte unmissverständlich einen elektrogenen Substrattransport für Af-Amt1 und Af-Amt3 und beschreibt die vollständige Charakterisierung beider Proteine in einem pH-equilibrierten System bei Nullspannung. Die SSM-Messungen verdeutlichen die funktionellen Unterschiede beider Proteine in Bezug auf die pH-Abhängigkeit, relative Transportraten und die Substrataffinitäten