University thesis:
Dissertation, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2017
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Abstract: Zusammenfassung<br><br>Die Bestimmung der Spezies von unbekanntem Gewebe ist in vielen Bereichen von Bedeutung, sei es die Lebensmittelindustrie oder aber bei strafrechtlichen Prozessen. Ein Verfahren, welches schnelle Ergebnisse liefert, kostengünstig und einfach zu handhaben ist und dabei noch eine hohe Spezifität besitzt, ist von großem Interesse. Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die Methode des Hochauflösenden Schmelzverfahrens in ihrer Zuverlässigkeit bei der Unterscheidung von Gewebe zu untersuchen. Die Methode des Hochauflösenden Schmelzverfahrens zur Unterscheidung von Spezies beruht auf der Bestimmung des Auftrennverhaltens des DNA-Doppelstranges. 31 verschiedene Spezies von insgesamt 286 Proben, welche sich auf neun Familien verteilen wurden differenziert. Hierzu wurden die mitochondrialen Genabschnitte 12S rRNA Gen und Cytochrom b Gen bestimmt. Die Messungen wurden am Rotor-Gene Q MDx Thermocycler der Firma Qiagen durchgeführt. Zuvor wurde als Referenz die DNA aus jeder Gewebeprobe extrahiert, sequenziert und anschließend mit Hilfe einer Kapillarelektrophorese eine Sequenzanalyse durchgeführt. Die Spezies von jeder Probe konnte durch die HRM-Analyse bestätigt werden. Bei der Konstanztestung konnte festgestellt werden, dass die Unterscheidung einer Spezies laufintern und laufübergreifend in Wiederholung korrekt möglich ist. Das Verhalten der Speziesbestimmung bei Verdünnung oder bei gleicher Konzentration der Proben zeigte, dass die DNA-Konzentration einen Einfluss auf die HRM-Analyse hat, ebenso wie die Extraktionsmethode und die Herkunft des Gewebes. Ein wesentlicher Bestandteil der Unterscheidung von Spezies ist eine unterschiedliche Anzahl an Wasserstoffbrücken-Bindungen, dies war bei der Untersuchung von Mischproben zu sehen. Allerdings lässt sich dieses Problem durch die Verwendung von spezifischen Primern umgehen. In einem Blindtest, bei dem zehn unbekannte Proben untersucht wurden, konnten alle Spezies bestimmt werden, was wiederum bestätigt, dass es sich bei der HRM-Analyse um eine geeignete Methode handelt, Spezies zuverlässig voneinander zu unterscheiden