Multiplexed miRNA biosensor for pediatric cancer diagnostics

Media type: E-Book

Title: Multiplexed miRNA biosensor for pediatric cancer diagnostics

Contributor: Bruch, Richard [Verfasser]; Urban, Gerald A. [Akademischer Betreuer]

Corporation: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Angewandte Wissenschaften

imprint: Freiburg: Universität, 2020

Extent: Online-Ressource

Language: English

DOI: 10.6094/UNIFR/158607

Identifier:

Keywords: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg ; Cancer in children ; CRISPR/Cas-Methode ; Bedside-Methode ; miRNS ; Krebs ; Tumor ; Tumormarker ; Kinderheilkunde ; Diagnostik ; Biosensor ; Elektrochemie ; Mikrosystemtechnik ; Cas13a ; (local)doctoralThesis

Origination:

University thesis: Dissertation, Universität Freiburg, 2019

Footnote:

Description: Abstract: Für die effektive Behandlung einer Krankheit ist eine genaue und frühzeitige Diagnose lebenswichtig, insbesondere bei Krebs. Allerdings werden Krankheiten oft nur dann diagnostiziert, wenn der Patient symptomatisch ist. Treten die Symptome erst in einem sehr späten Stadium der Erkrankung auf, kann dies zu einer höheren Sterblichkeit führen. In der Regel werden Untersuchungen aus Kostengründen nicht routinemäßig durchgeführt und Symptome auch gelegentlich falsch interpretiert. Um regelmäßige Untersuchungen für die breite Bevölkerung zugänglich zu machen, ist ein kostengünstiges, schnelles und zuverlässiges Diagnosesystem nötig. Hierfür könnte eine so genannte Lab-on-a-Chip (LOC)-Plattform zur On-Chip Diagnose ein vielversprechender Kandidat sein. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung einer solchen LOC-Plattform für den Nachweis von miRNAs als Biomarker für Hirnkrebs. Darüber hinaus kann das entwickelte Sensorprinzip auf verschiedene Krebsarten oder andere Krankheiten wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder Störungen des Nervensystems übertragen werden. Für den Nachweis der miRNAs wird ein elektrochemischer, mikrofluidischer Biosensor mit verschiedenen Assay-Typen kombiniert, die die Detektion nahezu jeder RNA ermöglicht. Darüber hinaus basiert die Biochip-Plattform auf einer kostengünstigen, polymerbasierten Fertigung. Für die Implementierung eines Assays zur miRNA Detektion wird eine neuartige Methode, basierend auf der kürzlich entdeckten CRISPR/Cas-Technologie, mit klassischen Assay-An-sätzen in Bezug auf Sensitivität, Selektivität und Flexibilität verglichen. Aufgrund seiner Überlegenheit in allen Bereichen wird das innovative CRISPR/Cas-basierte Assay als Detektionsprinzip gewählt. Für eine klinische Validierung werden verschiedene Serumproben von Kindern mit Medulloblastom (einer aggressiven Form von Hirnkrebs) mit der entwickelten LOC-Plattform analysiert. Die Resultate werden mit Messergebnissen einer qRT-PCR, dem aktuellen Goldstandard, verglichen, welche die Ergebnisse der LOC-Platform erfolgreich verifiziert. Zur Diagnose vieler Krankheiten reicht oft ein Biomarker als Nachweis nicht aus. Um eine Patientenprobe gleichzeitig auf mehrere Analyten hin zu untersuchen, wird die entwickelte LOC-Plattform in Richtung Multiplexing erweitert. Hierzu wird eine einkanalige Multianalyten-Lab-on-a-Chip-Plattform, genannt SCMultiLab, konzipiert. Für die Multianalytenmessung ist der Kanal in mehrere Detektionsstellen aufgeteilt, die durch inaktive Abschnitte getrennt sind. Zur Optimierung des Tetektionsprinzips wird der Einkanalbiosensor in ein Simulationsmodell überführt und verschiedene Designstudien durchgeführt. Aus den daraus hergeleiteten Designregeln werden verschiedene Versionen der SCMultiLab-Plattform hergestellt. Anschließend werden Grundsatzmessungen durchgeführt und schließlich miRNAs in verschiedenen Konzentrationen gemessen. Dies zeigt, dass der SCMultiLab-Chip ein sensibles und einfach zu skalierendes Diagnosewerkzeug ist, das den Weg für einen amplifikationsfreien Nukleinsäurenachweis ebnet

Abstract: For an effective treatment of a disease, an accurate and early diagnosis is vital, especially in the case of cancer. It is, therefore, problematic that diseases are often only diagnosed when the patient is already symptomatic. This can be at a very late stage of the disease, leading to higher mortality. Usually, examinations are not performed routinely due to high costs and additionally, the symptoms are occasionally misinterpreted. To enable regular screenings and to democratize them beyond the affluent population, a cost-effective, fast and reliable diagnostic system is essential. Herein, a so-called lab-on-a-chip (LOC) platform could be a promising candidate by empowering on-chip diagnostics. This thesis focuses on the development of such a LOC platform for the detection of miRNAs as biomarkers for pediatric brain cancer. Furthermore, the implemented miRNA sensing method can easily be transferred to different cancer types or other illnesses, such as cardiovascular conditions or diseases of the nervous system. In this study, an electrochemical microfluidic biosensor is combined with different assay types that enable targeting of almost any RNA, including miRNAs. Besides, the developed biochip platform is based on low-cost polymers, using the dry-film photoresist technology. In the course of implementing a miRNA targeting assay, a novel method based on the newly discovered CRISPR/Cas technology is compared with classical assay approaches in terms of sensitivity, specificity and flexibility. Due to its superior sensor performance, the innovative CRISPR/Cas-powered sensing approach is chosen for the assay implementation. For a clinical validation, various serum samples from children suffering from medulloblastoma (an aggressive form of brain cancer) are analyzed using the newly developed LOC platform. The findings are compared to the current gold standard by performing qRT-PCR measurements that successfully verify the results. For many different cancer types or other diseases, the detection of a single biomarker is not sufficient to ensure an accurate diagnosis. It is, therefore, desirable or even inevitable to analyze the patient sample for multiple analytes simultaneously. For this purpose, the developed LOC platform is expanded towards multiplexing. A single-channel multianalyte lab-on-a-chip platform, termed SCMultiLab, is designed, comprising several detection sites in one microfluidic channel, which enables the gauging of multiple analytes. In this context, the sensor geometry is transferred into a simulation model, executing various design studies to improve the multiplexing capability. The derived design rules are then used to implement different versions of the SCMultiLab platform. Subsequently, proof-of-principle experiments are performed, and finally, miRNAs at different concentrations are simultaneously measured. This confirms the applicability of the SCMultiLab platform as a sensitive and easily scalable diagnostic tool, paving the way for amplification-free nucleic acid detection

Access State: Open Access

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