Feinstaub aus der Biomasseverbrennung und seine Effekte auf das Transkriptom und Methylom von Bronchialepithelzellen und biologische Effekte auf humane Makrophagen

Media type: E-Book

Title: Feinstaub aus der Biomasseverbrennung und seine Effekte auf das Transkriptom und Methylom von Bronchialepithelzellen und biologische Effekte auf humane Makrophagen

Contributor: Heßelbach, Katharina [Author]; Merfort, Irmgard [Degree supervisor]

Corporation: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Published: Freiburg: Universität, 2018

Extent: Online-Ressource

Language: German

DOI: 10.6094/UNIFR/15591

Identifier:

Keywords: Epithelzelle ; Makrophage ; Feinstaub ; Bronchus ; Biomasse ; Transkriptom ; Verbrennung ; (local)doctoralThesis

Origination:

University thesis: Dissertation, Universität Freiburg, 2018

Footnote:

Description: Abstract: Weltweit wird Biomasse in Form von Holz als Energiequelle zum Heizen oder Kochen verwendet. Besonders in den Industrieländern der westlichen Welt gewinnt diese CO2-neutrale Energiequelle als Rohstoff zum Heizen zunehmend an Bedeutung. Bei der Verbrennung von Holz kommt es jedoch auch zur Freisetzung von Feinstaub (PM) in die Umgebungsluft. Dabei wird in den letzten Jahren vor allem Feinstaub zunehmend mit der Entstehung verschiedener Lungenerkrankungen, wie Asthma, COPD oder Infektionen der Atemwege, kardiovaskulären Erkrankungen sowie mit Krebs in Verbindung gebracht. Die biologischen Reaktionen, die der Entstehung dieser Erkrankungen zugrunde liegen, wurden bisher noch nicht hinreichend aufgeklärt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, die molekularen Auswirkungen einer PM-Exposition zu untersuchen, sowohl nach kurzzeitiger Exposition von humanen Makrophagen (THP-1) als auch nach längerer Exposition von humanen Bronchialepithelzellen (BEAS-2B). Der für diese Analysen verwendete Feinstaub stammt aus einem Biomassekraftwerk, in dem hauptsächlich Holzhackschnitzel von Weichhölzern des umliegenden Schwarzwaldes verbrannt wurden. Von dem dabei anfallendem Feinstaub wurde die alveolargängige Fraktion (PM2.5) untersucht. Bekannt war bereits ein hoher Anteil an Kalium und sehr geringe Mengen an Übergangsmetallen. In Kooperation konnte die Kenntnis der Zusammensetzung um das Vorliegen von relativ geringen Mengen an gesundheitsbedenklichen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen erweitert werden. Die kurzzeitige Exposition von THP-1 Makrophagen mit PM2.5 führte zu einer signifikant erhöhten Produktion von ROS, die jedoch keine zytotoxischen Auswirkungen hatten, da diese weder zu Nekrose noch zu Apoptose führten. Die Exposition mit PM2.5 hatte dennoch einen Einfluss auf die Zellviabilität, da eine Verminderung der metabolischen Aktivität sowie die Aktivierung der AMPK als auch die Inhibition der bei bei der Translation wichtigen Elongationsfaktors eEF2 beobachtet werden konnte. Der durch PM2.5 vermittelte oxidative Stress führte zu einer Aktivierung der MAP-Kinasen p38, JNK und ERK sowie zur Aktivierung von Akt. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass es zur nukleären Translokation und zur Aktivierung des stressinduzierten Transkriptionsfaktors Nrf-2 kam, was durch die MAP-Kinase JNK vermittelt wurde. Die Aktivierung von Nrf-2 induzierte zudem die Bildung des antioxidativen und antiinflammatorischen Proteins HO-1. Als zusätzliche Antwort auf den durch PM2.5 vermittelten oxidativen Stress wurde beobachtet, dass es zu einer moderaten Reduktion der GSSG-Konzentration mit einhergehender leichten Erhöhung der GSH-Konzentration kam, was vermutlich durch die Induktion der GSR verursacht wurde, da der Gesamtgehalt an GSH gleich blieb. Zusätzlich konnte mittels TEM Analysen nachgewiesen werden, dass die PM2.5 Exposition zur Stimulation von THP-1 Makrophagen führte, da es zur Ausbildung vermehrter Protrusionen kam, was vermutlich zur phagozytotischen Aufnahme von PM2.5 führte. In den Zellen lagen die Partikel hauptsächlich in membrangebundenen Vesikeln vor, die teilweise bereits Rupturen der Membran aufwiesen, was u. a. die Freisetzung des PM2.5 ins Zytosol begünstigt. Zudem konnte auch die Ausscheidung von PM2.5, vermutlich durch Exozytose aus den Zellen beobachtet werden. Darüber hinaus wurde auch die direkte Interaktion von PM2.5 mit Mitochondrien nachgewiesen sowie deren Schädigung, die sich als Schwellung und Zerstörung der Cristae äußerte. Da die Exposition mit PM2.5 aus der Biomasse in vielen Regionen oft eine chronische Belastung ist, wurden BEAS-2B für längere Zeit mit PM2.5 exponiert und die Auswirkungen auf die globale Genexpression untersucht. Die Veränderungen auf das Transkriptom PM2.5 exponierter BEAS-2B wurden mit dem Affymetrix GeneChip® Human Genome HG-U133 Plus 2.0 oligonucleotide Microarray untersucht. Die Verifizierung der Daten erfolgte mittels qRT-PCR für einige ausgewählte Gene. Bioinformatische Analysen wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe der pharmazeutischen Bioinformatik durchgeführt und ergaben 175 differenziell exprimierte Gene nach Exposition mit PM2.5. Die Durchführung einer Gen-Ontologie (GO) Analyse zeigte, dass diese Gene vor allem in verschiedenen zellulären Prozessen, wie zellulärer Entwicklung, Metabolismus, Entzündung und Krebs, eine Rolle spielen. Die in Kooperation durchgeführte Analyse potentieller Transkriptionsfaktoren lieferte den Hinweis, dass AhR und HIF-1 eine Rolle in der PM2.5 induzierten Genexpression spielen. Mittels qRT-PCR konnte für die Gene CYP1A1, EREG, GREM1, IL1B und IL6 nachgewiesen werden, dass der AhR und PAKs an der PM2.5 induzierten Genexpression beteiligt sind. Mittels qRT-PCR und Western Blot-Analyse konnte zudem zum ersten Mal für Verbrennungspartikel gezeigt werden, dass HIF-1 an der Induktion der Genexpression von HMOX1 und dessen Protein HO-1 beteiligt ist. Epidemiologische Studien ergaben, dass eine chronische PM Exposition zu einer erhöhten Anfälligkeit für Atemwegsinfektionen führte. Durch die Simulation eines viralen Infekts mittels Zugabe von dsRNA zu PM2.5 exponierten BEAS-2B wurden mögliche Veränderungen im Transkriptom PM2.5 exponierter Zellen untersucht, um Hinweise für diesen Zusammenhang zu erhalten. Eine GO zeigte, dass einige der 380 spezifischen, differentiell exprimierten Gene nach PM2.5 und dsRNA Exposition von BEAS-2B typisch für eine Antwort auf eine Virusinfektion sind. Zudem waren diese Gene meist herunterreguliert, was das Auftreten einer Atemwegsinfektion nach PM2.5 Exposition erklären würde. Zudem konnte eine durchgeführte Krankheitsontologie-Analyse zeigen, dass die Signifikanz lungenspezifischer Erkrankungen, die mit den differentiell exprimierten Genen PM2.5 exponierter BEAS-2B assoziiert wurden, durch die zusätzliche Exposition mit dsRNA erhöht wurde. Von langzeitexponierten BEAS-2B wurde neben dem Transkriptom auch das Methylom mit dem Illumina Infinium® HumanMethylation450 BeadChip (450K) untersucht, um den potentiellen Einfluss von PM2.5 aus der Biomasse auf epigenetische Mechanismen zu untersuchen. So konnte in Kooperation mit der Arbeitsgruppe der pharmazeutischen Bioinformatik gezeigt werden, dass die Exposition mit PM2.5 zu einer veränderten Methylierung von 1 % der untersuchten CpGs führte. Eine GO-Analyse ergab, dass Gene, die differentiell methylierte CpGs aufwiesen, eine wichtige Rolle in Signalwegen, die mit der extrazellulären Matrix, zellulären Adhäsion, der Funktion von GTPasen und der Antwort auf extrazelluläre Reize assoziiert sind, spielen. Um eine Aussage über die biologische Relevanz des veränderten Methyloms treffen zu können, wurden die Methylom-Daten mit den Transkriptom-Daten korreliert. Es wurden 152 Gene, die sowohl differentiell methylierte CpGs aufwiesen als auch differentiell exprimiert waren, erhalten. Des Weiteren zeigte die Durchführung einer Krankheitsontologie von diesen 152 Genen, dass viele dieser Gene im Zusammenhang mit Krebs und anderen lungenspezifischen und -unabhängigen Erkrankungen stehen. Insgesamt tragen die Ergebnisse dieser Arbeit dazu bei, die molekularen Mechanismen und epigenetischen Auswirkungen, die an der Entstehung von PM2.5 assoziierten Lungenerkrankungen beteiligt sind, besser zu verstehen. Dabei kann die Entdeckung von potentiellen PM2.5-Targetgenen ein möglicher Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen sein

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