Effekte membranaktiver Substanzen auf Modell- und Biomembranen

Media type: E-Book

Title: Effekte membranaktiver Substanzen auf Modell- und Biomembranen

Contributor: Dietel, Lisa [Verfasser]; Heerklotz, Heiko [Akademischer Betreuer]

Corporation: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Chemie und Pharmazie

imprint: Freiburg: Universität, 2020

Extent: Online-Ressource

Language: German

DOI: 10.6094/UNIFR/167970

Identifier:

Keywords: Calcein ; Membran ; Verbundwerkstoff ; Keramischer Werkstoff ; Fungizid ; Liposom ; Antimikrobieller Wirkstoff ; Fluoreszenzspektroskopie ; Asymmetrie ; Zellkultur ; Detergentien ; Lipid-Flipflop ; (local)doctoralThesis

Origination:

University thesis: Dissertation, Universität Freiburg, 2020

Footnote:

Description: Abstract: Promising approaches to fight bacteria and cancer or replace pesticides are based on membrane-active substances, especially antimicrobial peptides. Usually, detailed studies of the mode of action start with research on model membranes. The complexity of the pathogen is reduced to the relevant properties in order to enable an interpretation of the study outcome. The advantage of model systems is a disadvantage at the same time. Properties of the organism that possibly have an influence on the interaction with the membrane-active substances are neglected. Therefore, the aim of this thesis was a critical evaluation of membrane model systems in comparison to biological organisms. In addition, model systems were (further) developed to render them more meaningful for biological systems. The main focus was on cyclic lipopeptides of B. subtilis (CLPs) and on non-ionic detergents, such as C12EO8, OG, and LM. The quantification of membrane permeabilization induced by non-ionic detergents and CLPs was performed with liposomal calcein leakage and conductivity measurements on planar membranes. The results of different methods were compared to each other. To detect further membrane defects, an assay was developed to measure the detergent-induced lipid flip from the outer to the inner leaflet in liposomes. The main tool of the assay was the ζ potential. To calculate the concentration of the active substance causing a certain effect, the partition coefficient of detergents in the membrane and the detergent concentration required for membrane solubilization were determined. The results of the measurements on model membranes were related to investigations on human cervical carcinoma cells and a B. cineara culture. The investigation of the CLP-induced permeabilization of membranes showed no detectable influence of curvature. Fengycin induces first membrane defects at 5 μM after 1 h; from 20 μM on, the membrane is nearly destroyed. Iturin does not induce calcein leakage but small pores in planar membranes, which can be detected by conductivity. Presumably, the Iturin-induced pores are too small for calcein diffusion. In comparison to calcein leakage, the newly developed assay shows that, especially after a longer incubation period, lipid flip occurs at significantly lower detergent concentrations than leakage. After 24 h, 50 % of the lipid asymmetry is already eliminated by 0.06 C12EO8 per lipid in the membrane. 50 % leakage is only induced by 0.18 per lipid. Within a short incubation period (10 min), similar concentrations are required to induce equilibrium-controlled lipid flip (0.22) and concentration-controlled leakage (0.24). In all cases, membrane solubilization starts only after concentrations above the leakage threshold. Using CMC and solubilization experiments, it was found that the viability of cervical cancer cells after treatment with C12EO8 decreases above the concentration of solubilization. Carcinoma cells in particular have the ability to adapt to many external conditions, what is not easily considered in model systems. The calorimetric studies on a B. cineara culture with fengycin suggested that the inhibitory effect occurs on a long time scale. Literature suggests that the fungicidal effect of fengycin is not exclusively due to its membrane activity, but also to its ability to stimulate the formation of a rhizobacterial biofilm. The studies on living organisms showed that a good understanding of the effect of investigated substances is crucial for the correct interpretation of the measurement results

Abstract: Membranaktive Substanzen, vor allem antimikrobielle Peptide, sind Hoffnungsträger auf der Suche nach neuen Wirkstoffen gegen Bakterien, Schädlinge und Krebserkrankungen. Die genauen Untersuchungen des Wirkmechanismus beginnen meist mit Studien an Modellmembranen. Die Komplexität des Erregers wird so auf die relevanten Eigenschaften reduziert, um eine Interpretation der Studienergebnisse zu ermöglichen. Der Vorteil von Modellsystemen ist gleichzeitig auch ein Nachteil, da Eigenschaften des Organismus, die einen möglichen Einfluss auf die Wechselwirkung mit den membranaktiven Substanzen haben, vernachlässigt werden. Daher war eine kritische Evaluation von Membranmodellsystemen im Vergleich zu biologischen Organismen das Ziel dieser Arbeit, um die Aussagekraft der Modellsysteme im Bezug auf die biologischen Systeme zu verbessern. Außerdem wurden Modellsysteme (weiter-)entwickelt, um eine Brücke zu biologischen Systemen zu bilden. Das Hauptaugenmerk wurde hier auf die zyklischen Lipopeptide des B. subtilis (CLPs) und auf die nichtionischen Detergenzien C12EO8, OG und LM gelegt. Die Quantifizierung der Membranpermeabilisierung induziert durch nichtionische Detergenzien und den CLPs wurde mittels Calcein-leakage aus Liposomen und Leitfähigkeitsmessungen an planaren Membranen durchgeführt und die Ergebnisse beider Methoden miteinander verglichen. Zur Detektion weiterer Membrandefekte wurde ein Assay entwickelt, um den induzierten Lipid-Flip von der äußeren in die innere Membranschicht in Liposomen durch das ζ-Potential zu messen. Dazu wurden zu Beginn die Verteilungskoeffizienten der Detergenzien in der Membran und die Detergenskonzentrationen zur Membransolubilisierung bestimmt. Die Ergebnisse der Messungen an Modellmembranen wurden im Folgenden für die Auswertung der Untersuchungen an humanen Zervixkarzinom-Zellen und einer B. cineara Kultur zur Hilfe genommen. Die Untersuchung der CLP-induzierten Permeabilisierung zeigte, dass hier kein Einfluss der Membrankrümmung zu erkennen ist. Fengycin induziert nach 1 h Membrandefekte ab 5 μM, ab 20 μM derartige Schäden, dass die Membran nahezu vollständig zerstört ist. Iturin induziert keinen Calcein-leakage, jedoch kleine Poren in planaren Membranen, die durch erhöhte elektrische Leitfähigkeit detektiert werden können. Vermutlich sind Iturin-induzierte Poren zu klein, dass Calcein durchdiffundieren kann. Der neu entwickelte Assay zur Detektion des Lipid-Flips zeigt im Vergleich zum Calcein-leakage, dass vor allem nach längerer Inkubationszeit der Lipid-Flip bei deutlich geringeren Detergenskonzentrationen abläuft als leakage. Nach 24 h ist 50 % der Lipidasymmetrie bereits durch 0,06 C12EO8 pro Lipid in der Membran aufgehoben, 50 % leakage erst mit 0,18 pro Lipid induziert. Nach kurzer Inkubationszeit (10 min) werden ähnliche Konzentrationen zur Induzierung des gleichgewichtsgesteuerten Lipid-Flips (0,22) und des konzentrationsgesteuerten leakage (0,24) benötigt. Die Membransolubilisierung beginnt in allen Fällen erst bei Konzentrationen oberhalb des leakage. Mithilfe der kritischen Mizellbildungskonzentration und der Solubilisierungs-experimente konnte festgestellt werden, dass die Viabilität von Zervixkarzinom-Zellen nach der Behandlung mit C12EO8 erst oberhalb der Solubilisierungskonzentration abnimmt. Gerade Karzinomzellen besitzen die Fähigkeit, sich an viele äußere Umstände anzupassen, was in Modellsystemen nicht so einfach berücksichtigt werden kann. Die kalorimetrischen Studien an einer B. cineara Kultur mit Fengycin ließen darauf schließen, dass die inhibitorische Wirkung auf einer breiten Zeitskala passiert. Mithilfe der Literatur ist davon auszugehen, dass die fungizide Eigenschaft des Fengycins nicht ausschließlich auf seine Membranaktivität zurückzuführen ist, sondern ebenfalls auf die Fähigkeit die Bildung eines Rhizobakterien-Biofilms anzuregen. Die Studien an lebenden Organismen zeigen, dass ein gutes Verständnis über die zu untersuchenden Substanzen essentiell für die richtige Interpretation der erhaltenen Messergebnisse ist

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