Intrinsic properties of reticulated platelets

Media type: E-Book

Title: Intrinsic properties of reticulated platelets

Contributor: Hille, Laura [Author]; Trenk, Dietmar [Degree supervisor]

Corporation: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Published: Freiburg: Universität, 2020

Extent: Online-Ressource

Language: English

DOI: 10.6094/UNIFR/165863

Identifier:

Keywords: Blood platelets ; (local)doctoralThesis

Origination:

University thesis: Dissertation, Universität Freiburg, 2020

Footnote:

Description: Abstract: Reticulated platelets (RP) are released from megakaryocytes into the blood stream and constitute the youngest platelets in circulation. They represent a highly active prothrombotic platelet subpopulation associated with an increased risk for cardiovascular events, mortality and impaired response to antiplatelet pharmacotherapy. The underlying mechanisms for this hyperreactive potential of RP are poorly understood so far. Recent studies suggested that not only quantity, but particularly intrinsic features of RP are causal for their prothrombotic nature. In this investigation, a new assay for determination of RP by flow cytometry with the option of subsequent cell sorting of RP and non-RP was developed. The nucleic-acid staining dye SYTO 13, which binds to platelet RNA, is used in this assay. As platelets are of anucleate nature, their RNA content decreases throughout their lifespan and hence RP contain the highest amount of RNA. The SYTO 13 staining was shown to be superior to the current standard of RP determination by flow cytometry using thiazole orange in terms of stability and correlation to the clinically used RP measurement by a fully automated assay from Sysmex Co. Subsequent cell sorting of RP and non-RP (as control) allowed for several downstream investigations to further characterize intrinsic properties of these platelet subpopulations. First, an ultrastructural analysis based on visualization of sorted platelets by transmission electron microscopy was performed. An almost 2-fold higher cross sectional area of RP compared to non-RP was determined. Higher numbers of α-granules, dense granules and openings from the open canalicular system may support enhanced granule release reactions of RP. Surrogates of platelet activation, namely pseudopodia formation and shape change, are more present in RP as well. Despite the lack of a nucleus in platelets, the presence of Golgi apparatus and rough endoplasmic reticulum only in RP suggests the capability of protein biosynthesis. Second, a transcriptomic analysis of RP and non-RP in healthy subjects as well as in patients with chronic coronary syndrome and ST-elevation myocardial infarction (STEMI) revealed a prothrombotic mRNA profile of RP in all cohorts. Several key players involved in the platelet activation cascade, e.g. GP 9, GP 6, GP IIb, GP IIIa and P-selectin, are upregulated in RP. Highest enrichment of these transcripts was determined in RP from STEMI-patients. Last, P-selectin expression in platelets from healthy subjects without intake of antiplatelet medication and from patients on P2Y12-inhibitor therapy was determined in a flow cytometric functional assay. Higher amounts of surface P-selectin were determined in ADP- and TRAP stimulated RP from healthy subjects compared to non-RP. In patients on clopidogrel and prasugrel, the increase of P-selectin was similar in RP and non-RP after ADP stimulation (due to the pharmacological effect of P2Y12 inhibitors), but still higher in RP after TRAP stimulation. These results indicate a higher potential of RP to express surface activation markers. In summary, these findings contribute to the general understanding of underlying mechanisms of platelet aging and physiology. Quantitative and qualitative differences of platelet ultrastructure as well as an altered platelet transcriptome may contribute to the hyperreactive potential of RP and their increased ability to incorporate into platelet thrombi. Inhibition of platelet aggregation for prevention of ischemic events is the cornerstone of medical therapy in distinct clinical conditions especially in interventional cardiology. Optimization of antiplatelet therapy in recent years was achieved at the expense of an increased bleeding risk. Hence, selective inhibition of RP – the most prothrombotic and hyperreactive platelet subfraction – without affecting the rest of the platelet pool might be an attractive approach to improve the balance between benefit and harm. Further studies are needed to identify appropriate targets for this approach

Abstract: Retikulierte Plättchen (RP) sind von Megakaryozyten in den Blutstrom entlassene Thrombozyten und stellen die jüngsten Plättchen im Blutkreislauf dar. Sie repräsentieren eine hochaktive prothrombotische Plättchen-Subpopulation, die mit einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse und Sterblichkeit sowie einer verminderten Wirkung der plättchenhemmenden Therapie assoziiert ist. Die zugrunde liegenden Mechanismen für dieses hyperreaktive Potential von RP sind bislang wenig bekannt. Aktuelle Studien postulieren, dass nicht nur die Quantität von RP ursächlich für diese prothrombotischen Eigenschaften ist, sondern im Besonderen auch deren intrinsische Charakteristika. In dieser Untersuchung wurde eine neue durchflusszytometrische Methode zur Bestimmung von RP mit der anschließenden Option einer Zellsortierung von RP und nicht-RP entwickelt. Der an Plättchen-RNA bindende Nukleinsäure-Farbstoff SYTO 13 wurde in diesem Assay verwendet. Da Plättchen zellkernlos sind, verringert sich der RNA Gehalt in der Zelle während der Lebensspanne eines Plättchens immer weiter. Daher haben RP den höchsten RNA-Gehalt. Es konnte gezeigt werden, dass die auf SYTO 13 basierende Färbemethode in Bezug auf Stabilität sowie Korrelation zur etablierten voll-automatischen RP-Messmethode der Firma Sysmex dem bislang vielfach verwendeten Standard der Färbung mittels Thiazol Orange überlegen ist. Anschließende Zellsortierung von RP und nicht-RP (als Kontrolle) ermöglichte darauf folgende Untersuchungen mit dem Ziel der weiteren Charakterisierung von intrinsischen Eigenschaften dieser zwei Plättchen-Subpopulationen. Zunächst wurde eine ultrastrukturelle Analyse, basierend auf einer Visualisierung mittels Transmissionselektronenmikroskopie, durchgeführt. Es ergab sich eine fast doppelt so große Querschnittsfläche von RP im Vergleich zu nicht-RP. Eine höhere Anzahl an α-Granula, dichten Granula sowie Öffnungen des offenen Kanalsystems in RP könnten eine gesteigerte Degranulation ermöglichen. Surrogate der Plättchenaktivierung, in diesem Fall die Bildung von Pseudopodien sowie die Formveränderung, sind in RP ebenfalls häufiger nachweisbar. Obwohl Plättchen zellkernlos sind, konnten ausschließlich in RP Golgi Apparat sowie raues endoplasmatisches Retikulum visualisiert werden, was auf die Möglichkeit der Proteinbiosynthese hindeutet. Zudem wurde eine Transkriptomanalyse in sortierten Plättchen von gesunden Probanden sowie von Patienten mit chronischem Koronarsyndrom und ST-Hebungsinfarkt (STEMI) durchgeführt und ein hohes prothrombotisches mRNA Profil in RPs von allen drei Kohorten festgestellt. Diverse Transkripte, welche in die Plättchenaktivierungskaskade involviert sind, sind in RP hochreguliert, wie beispielsweise GP 9, GP 6, GP IIb, GP IIIa und P-Selektin. Die höchste Anreichung dieser Transkripte hat sich hier bei den STEMI-Patienten gezeigt. Zuletzt wurde die P-Selektin Expression von gesunden Probanden ohne antithrombozytäre Therapie sowie von Patienten unter P2Y12-Inhibitor-Therapie mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Oberflächenexpression von P-Selektin in ADP- und TRAP-stimulierten RP von gesunden Probanden ist im Gegensatz zu nicht-RP erhöht. Bei Patienten unter Clopidogrel- und Prasugreltherapie war die Zunahme der P-Selektin-Expression in RP und nicht-RP nach ADP-Stimulation vergleichbar (bedingt durch die pharmakologische Wirkung der P2Y12 Inhibitoren), aber dennoch höher in RP nach TRAP-Stimulation. Diese Ergebnisse deuten auf ein höheres Potential der Expression von Oberflächen-Aktivierungsmarkern in RP hin. Zusammenfassend erweitern diese Ergebnisse das generelle Verständnis der Mechanismen der Plättchenalterung und -physiologie. Quantitative und qualitative ultrastrukturelle Unterschiede sowie ein verändertes Plättchentranskriptom von RP tragen möglicherweise zu deren hyperreaktivem Potential und erhöhter Fähigkeit in Thromben zu inkorporieren bei. Die Hemmung der Plättchenreaktivität zur Prävention ischämischer Ereignisse ist ein Eckpfeiler der medikamentösen Therapie in verschiedenen klinischen Konstellationen, insbesondere in der interventionellen Kardiologie. Die in den letzten Jahren erreichte Optimierung der plättchenhemmenden Wirkung wurde allerdings mit einer Zunahme von Blutungskomplikationen erkauft. Die selektive Inhibition von RP – die die Subfraktion des Plättchenpools mit erhöhter Reaktivität und prothrombotischen Eigenschaften darstellen – könnte daher einen attraktiven Ansatz zur Verbesserung des Nutzen Risiko Verhältnisses der plättchenhemmenden Therapie darstellen. Zur Identifikation geeigneter Targets sind jedoch weitere Studien erforderlich

Access State: Open Access

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