Alternative B-cell activation by the fucose-binding Burkholderia ambifaria lectin BambL

Media type: E-Book

Title: Alternative B-cell activation by the fucose-binding Burkholderia ambifaria lectin BambL

Contributor: Frensch, Marco [Author]; Römer, Winfried [Degree supervisor]

Corporation: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Biologie ; Synthetic Biology of Signalling Processes

Published: Freiburg: Universität, 2021

Extent: Online-Ressource

Language: English

DOI: 10.6094/UNIFR/175878

Identifier:

Keywords: Immunologie ; Mikrobiologie ; Lectine ; B-Zelle ; (local)doctoralThesis

Origination:

University thesis: Dissertation, Universität Freiburg, 2020

Footnote:

Description: Abstract: The bacterial lectin BambL has been puzzling our lab for years. We have discovered the small, highly affine fucose-binding protein of the opportunistic human pathogen Burkholderia ambifaria to potently activate B lymphocytes of our adaptive immune system, which seems counterintuitive from a pathogen’s perspective. Aiming at unraveling some of the mystery, we investigated cellular responses to BambL exposure in isolated human B cells and the model cell line Ramos. Initially, we assessed the lectin’s localization in B. ambifaria as part of an ongoing study in the murine context. Surprisingly, BambL was retained in the cytoplasm when bacteria were cultivated as biofilms, which suggests BambL not to function as an adhesion factor like other bacterial lectins. We then concentrated on isolated peripheral human B cells, which BambL polyclonally activated (increase of markers CD69, CD86 and CD54) through SYK, PI3K and ERK1/2 signaling pathways. At the same time, BambL became increasingly cytotoxic with rising concentrations, presumably through activation-induced cell death. Cell activation and death could both be prevented by blocking the lectin’s binding sites with excess fucose. In the cell line Ramos, we then identified the glycans of the B cell receptor (BCR) and regulatory coreceptors as molecular targets for BambL, demonstrated the activation of BCR signaling and discovered a depletion of CD19. Our results were incorporated in two publication manuscripts, one of which has already been published. Both manuscripts are integrated into this thesis. Earlier studies with a structurally similar protein had demonstrated that the valency and spacing of binding sites can determine a lectin’s potential to cluster receptors. We therefore attempted to recombinantly produce an engineered version of BambL, called neoBambL, and mutants with controlled valency and binding site geometry to be used as molecular tools in the study of receptor cluster organization. However, we were unable to prevent the constructs from aggregating during their expression. Also, our efforts to reconstitute denatured neoBambL were hardly successful. In the end, we were unable to obtain sufficient protein amounts to pursue comparative cell stimulation tests, which is why we here discuss our insights in production and purification of neoBambL and make suggestions for future approaches. Because BambL potently binds and internalizes in human cells, we utilized the lectin as a model stimulant in another project: We developed a novel microfluidic biochip design for high-resolution fluorescence microscopy which allows manipulating the basolateral microenvironment of epithelia in a locally confined fashion. The polydimethylsiloxane-based biochip was manufactured in separate layers and assembled manually. Epithelial cells grown on the chip surface established a polarized monolayer, underneath which a microfluidic channel system was operated with fine-pressure pumps. BambL was applied via the flow system and reached the basolateral cell membranes through pores of only 5 µm diameter. Importantly, the biochip’s design allowed us to image the lectin binding and uptake into live cells with an inverse confocal microscope, leaving the apical cell surface accessible to correlated analysis with an atomic-force microscope (AFM). The project results have been published and the manuscript is reprinted in this thesis. In conclusion, we describe BambL to bear excellent functional resemblance to classical B cell superantigens, whose polyclonal B-cell activation is presumed to confound adaptive immune responses and dampen the clearance of bacterial infections. Similarly, we propose the multivalent lectin BambL to engage in multiple receptor interactions, thereby excessively activating B cells and driving them into exhaustion and apoptosis. Owing to its high valency and avidity at small protein dimensions, BambL further appeals as a molecular tool to examine the clustering behavior of glycosylated receptors in many more contexts

Abstract: Das bakterielle Lektin BambL ist unserem Labor schon seit Jahren ein Rätsel. Wir entdeckten, dass das kleine, höchst Fucose-affine Protein des opportunistischen menschlichen Pathogens Burkholderia ambifaria effektiv B-Lymphozyten unseres adaptiven Immunsystems aktiviert, was aus Sicht eines Pathogens unsinnig wirkt. Mit dem Ziel, einen Teil dieses Mysteriums aufzuklären, untersuchten wir zelluläre Antworten auf BambL-Exposition in isolierten menschlichen B-Zellen und der Modell-Zellline Ramos. Zu Beginn erforschten wir die Lokalisierung des Lektins in B. ambifaria im Rahmen einer bereits laufenden Studie im murinen Kontext. Überraschenderweise wurde BambL im Zytoplasma der als Biofilm kultivierten Bakterien zurückgehalten, was andeutet, dass BambL nicht wie andere Lektine als Adhäsionsfaktor fungiert. Wir konzentrierten uns dann auf isolierte, periphere menschliche B-Zellen, die BambL via SYK-, PI3K- und ERK1/2-Signalwegen polyklonal aktivierte (Anstieg der Marker CD69, CD86 und CD54). Gleichzeitig wurde BambL mit steigender Konzentration zunehmend zytotoxisch, vermutlich durch „activation-induced cell death“. Zellaktivierung und -tod konnten beide durch Blocken der Lektinbindestellen mit einem Überschuss Fucose verhindert werden. In der Zelllinie Ramos identifizierten wir dann die Glykane des B-Zellrezeptors (BCR) und regulatorischer Korezeptoren als molekulare Angriffspunkte für BambL, demonstrierten die Aktivierung der BCR-Signalübertragung und entdeckten einen Verlust an CD19. Unsere Ergebnisse wurden in zwei Publikationsmanuskripten eingearbeitet, von denen eines bereits publiziert wurde. Beide Manuskripte sind in diese Thesis eingebunden. Frühere Studien mit einem strukturell ähnlichen Protein hatten gezeigt, dass Valenz und Abstand der Bindestellen eines Lektins seine Fähigkeit bestimmen können, Rezeptoren zu clustern. Wir versuchten rekombinant eine veränderte Version von BambL, neoBambL genannt, sowie Mutanten mit kontrollierter Valenz und Geometrie der Bindestellen zu produzieren, um sie als molekulare Werkzeuge in Untersuchungen der Rezeptor-Clusterorganisation einzusetzen. Wir schafften es jedoch nicht die Konstrukte daran zu hindern, während ihrer Expression zu aggregieren. Unsere Bemühungen, denaturiertes neoBambL zu rekonstituieren, waren ebenfalls wenig erfolgreich. Die Proteinmengen, die wir schlussendlich erzielten, waren für vergleichende Zell-Stimulationstests nicht ausreichend, weshalb wir hier unsere Erkenntnisse zur Produktion und Aufreinigung neoBambLs diskutieren und Vorschläge für zukünftige Ansätze erarbeiten. Weil BambL effektiv menschliche Zellen bindet und in sie internalisiert, verwendeten wir das Lektin als Modellstimulus in einem weiteren Projekt: Wir entwickelten ein neuartiges Design eines Mikrofluidik-Biochips für hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie, welcher es ermöglicht das basolaterale Mikromilieu eines Epithels in räumlich begrenzter Weise zu manipulieren. Der auf Poly-Dimethylsiloxan basierende Biochip wurde in einzelnen Schichten produziert und manuell zusammengesetzt. Auf der Chipoberfläche wachsende Epithelzellen bildeten ein polarisiertes, einschichtiges Zellsystem aus, unter welchem ein Mikrofluidik-Kanalsystem mit Feindruck-Pumpen betrieben wurde. BambL wurde durch das Strömungssystem appliziert und erreichte die basolateralen Zellmembranen durch Poren von nur 5 µm Durchmesser. Entscheidend ist, dass das Biochip-Design es uns ermöglichte, die Bindung und Aufnahme des Lektins in lebenden Zellen mit einem inversen konfokalen Mikroskop abzubilden, was wiederum die apikale Zelloberfläche für eine korrelierte Analyse mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) freihielt. Die Projektergebnisse wurden publiziert und das Manuskript ist in dieser Thesis nachgedruckt. In der Schlussfolgerung legen wir dar, dass BambL auf exzellente Weise der Funktion klassischer B Zell-Superantigene gleicht, deren polyklonale B Zellaktivierung mutmaßlich die adaptive Immunantwort und die Beseitigung bakterieller Infektionen stört. Gleichermaßen, so vermuten wir, geht BambL multiple Rezeptorinteraktionen ein, aktiviert dadurch B Zellen auf exzessive Weise und treibt sie in die Erschöpfung und Apoptose. Dank seiner hohen Valenz und Avidität bei gleichzeitig geringer Proteingröße bietet sich BambL außerdem als molekulares Werkzeug für Untersuchungen des Clustering-Verhaltens glykosylierter Rezeptoren in vielen weiteren Kontexten an

Access State: Open Access

Rights information: Attribution - Non Commercial - No Derivs (CC BY-NC-ND)

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