Analyse von Intermediaten des Nitrogenase-FeMo-Kofaktors mittels ESR-Spektroskopie und Tikhonov-Regularisierung

Media type: E-Book

Title: Analyse von Intermediaten des Nitrogenase-FeMo-Kofaktors mittels ESR-Spektroskopie und Tikhonov-Regularisierung

Contributor: Heidinger, Lorenz [Verfasser]; Weber, Stefan [Akademischer Betreuer]; Schleicher, Erik [Akademischer Betreuer]

Corporation: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Chemie und Pharmazie ; Magnetische Resonanz

imprint: Freiburg: Universität, 2021

Extent: Online-Ressource

Language: German

DOI: 10.6094/UNIFR/222211

Identifier:

Keywords: Elektronenspinresonanzspektroskopie ; Reaktive Zwischenstufe ; Nitrogenase ; Elektronenspinresonanz ; Regularisierungsverfahren ; Tichonov-Regularisierung ; ESEEM ; Selen-77 ; Cofaktor ; Azotobacter vinelandii ; HYSCORE ; FeMo-Kofaktor ; (local)doctoralThesis

Origination:

University thesis: Dissertation, Universität Freiburg, 2021

Footnote:

Description: Abstract: Stickstoff ist eines der grundlegenden Elemente zum Aufbau von Aminosäuren, DNA und RNA und ist daher von fundamentaler Bedeutung für das Leben. In der Atmosphäre kommt Stickstoff als Distickstoff (N2) vor. Dieses Molekül ist auf Grund der Dreifachbindung chemisch recht inert und somit für chemische Prozesse schwer zugänglich. Leichter zugänglich ist hingegen Ammoniak (NH3), welches unter anderem für Düngemittel, wie zum Beispiel Ammoniumsulfat, genutzt wird. Großtechnisch wird Ammoniak aus Wasserstoff und Stickstoff über das Haber-Bosch-Verfahren bei hohen Drücken und Temperaturen erzeugt. In der Natur sind einige Bakterien, wie z. B. Azotobacter vinelandii, in der Lage, aus Distickstoff Ammoniak zu synthetisieren, was als Stickstofffixierung bezeichnet wird. Das Protein bzw. genauer der Proteinkomplex, der diese Synthese-Reaktion katalysiert, ist der Nitrogenase-Proteinkomplex. Im Gegensatz zum Haber-Bosch-Verfahren läuft die Biosynthese bei nahezu Standardbedingungen ab. Eine genauere Erforschung des Mechanismus der Nitrogenase ist daher von großem Interesse. Die eigentliche Stickstofffixierung findet am sogenannten Eisen-Molybdän-Kofaktor (Mo7Fe9SC-Homozitrat-Kofaktor; Abk.: FeMo-Kofaktor) statt. Dieser Kofaktor ist seit Jahren im Fokus der Forschung. Zur Untersuchung dieses Kofaktors werden unterschiedlichste Methoden eingesetzt. Neben der Kristallstrukturanalyse finden unter anderem die Mößbauer-Spektroskopie, die Röntgenabsorptionsspektroskopie und die Elektronenspinresonanz (ESR) eine breite Anwendung.<br>In den letzten Jahren konnte herausgefunden werden, dass einige Schwefelatome des FeMo-Kofaktors während der Katalyse ausgetauscht werden können, unter anderem durch Selen. Im Zuge dieser Arbeit wird der Austausch von Schwefel gegen Selen innerhalb des FeMo-Kofaktors mit Hilfe der ESR-Spektroskopie näher untersucht. Hierzu werden sowohl Puls-ESR-Methoden als auch Continuous-wave-ESR-Methoden (CW-ESR) verwendet. Zur Auswertung der CW-ESR-Spektren wird die Methode der Tikhonov-Regularisierung angewendet und diskutiert, an Modelldatensätzen getestet und mit anderen Methoden, wie der Grid-of-Errors-Methode, verglichen. Die Regularisierung erweist sich als sehr nützliche Methode zur Analyse der CW-ESR-Spektren des FeMo-Kofaktors, wenn dieser in mehreren Zuständen vorliegt. Die unterschiedlichen Zustände des FeMo-Kofaktors lassen sich durch eine Tikhonov-Regularisierung mit geringem Rechenaufwand gut analysieren. Es zeigt sich, dass sich diese unterschiedlichen Zustände des selenmarkierten FeMo-Kofaktors in den Nullfeldparametern und darüber hinaus in ihrem Relaxationsverhalten unterscheiden. Diese Zustände können unterschiedlichen Intermediatzuständen des FeMo-Kofaktors während der Katalyse-Reaktion zugeordnet werden. Die Methode der Selenmarkierung kann somit zur Stabilisierung von Intermediaten des FeMo-Kofaktors genutzt werden. Zudem können mit Hilfe von 3P-ESEEM-Experimenten (3-Puls-Electron-spin-echo-envelope-modulation) am selenmarkierten (77Se-) und 33S-markierten FeMo-Kofaktor weitere Informationen über die Struktur des Kofaktors gewonnen werden. Diese Erkenntnisse tragen zum weiteren Verständnis des Mechanismus der Stickstofffixierung am FeMo-Kofaktor bei.<br>Seit einigen Jahren ist bekannt, dass das für lange Zeit unbekannte zentrale Atom des FeMo-Kofaktors ein Kohlenstoffatom ist. In dieser Arbeit werden Puls-ESR-Methoden wie 3P-ESEEM und HYSCORE (Hyperfine-sublevel-correlation) verwendet, um die Hyperfeinkopplungen dieses Kohlenstoffs genauer bestimmen zu können. Ausgehend von der Analyse dieser Experimente wird die Möglichkeit zweier elektronisch nicht äquivalenter zentraler Kohlenstoffatome der beiden FeMo-Kofaktoren des Nitrogenase-Komplexes diskutiert

Abstract: Nitrogen is one of the essential elements for the construction of amino acids, DNA and RNA, and is therefore of fundamental importance for life on earth. Nitrogen is found as di-nitrogen (N2) in the atmosphere. Due to the triple bond, this molecule is chemically rather inert and therefore difficult to access in chemical processes. More easily accessible is ammonia (NH3), which is used among others for fertilizers such as ammonium sulphate. On an industrial scale, ammonia is produced by the Haber-Bosch-process at high pressures and high temperatures. In nature, some bacteria such as Azotobacter vinelandii are able to synthesize ammonia from di-nitrogen, a process known as nitrogen fixation. The protein, more precisely the protein complex, that catalyses this reaction is the nitrogenase-protein complex. In contrast to the Haber-Bosch-method, the biological synthesis takes place under almost standard conditions of temperature and pressure. More detailed research of the molecular mechanism of nitrogenase is therefore of great scientific interest. The actual nitrogen fixation takes place at the so-called iron-molybdenum cofactor (Mo7Fe9SC-homo-citrate cofactor; abbreviation: FeMo-cofactor). This cofactor has been the focus of research for several years. A large variety of methods are used to investigate this cofactor. Besides X-ray crystal structures, Mößbauerspectroscopy, X-ray absorption spectroscopy and electron paramagnetic (EPR) resonance are widely used.<br>In recent years, it has been found that some sulphur atoms of the FeMo-cofactor can be exchanged during catalysis (turnover). Among others, this exchange has been done by selenium. In the course of this work, the exchange of sulphur with selenium within the FeMo-cofactor is investigated in more detail by using electron paramagnetic resonance (EPR). For this purpose, methods such as pulse EPR and continuous-wave EPR methods (CW-EPR) are used. To evaluate the CW-EPR spectra, the Tikhonov-regularization method is applied and discussed. This method is tested on model data sets and compared with other methods, such as the grid-of-errors approach. The regularization proves to be a very useful method to analyze the CW-ESR spectra of the FeMo-cofactor, if the cofactor is present in several states. The different states of the FeMo-cofactor can be well analyzed by a Tikhonov-regularization with relatively little computational effort. It turns out that the different states of the selenium-labeled FeMo-cofactor differ in the zero-field parameters and, moreover, in their relaxation behavior. These states can be assigned to different intermediates of the FeMo-cofactor during the turnover reaction. The selenium labeling can therefore be used to stabilize intermediate states of the FeMo-cofactor. In addition, 3P-ESEEM (3-Pulse-Electron spin echo envelope modulation) experiments of the selenium-labeled (77Se-) and 33S-labeled FeMo-cofactor can be used to obtain further information about the electronic structure of the cofactor. These results contribute to a deeper understanding of the mechanism of nitrogen fixation at the FeMo-cofactor.<br>It has been known for a number of years that the central atom of the FeMo-cofactor, unknown for a long time, must be a carbon atom. It is the aim of this work to determine more precisely the hyperfine couplings of this carbon atom by using pulse EPR methods like 3P-ESEEM and HYSCORE (Hyperfine sublevel correlation). Based on analysis of these experiments the possibility of two electronic non-equivalent central carbon atoms inside the two FeMo-cofactors in the nitrogenase complex is also discussed

Access State: Open Access

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