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AbstractFormylglycin‐generierende Enzyme haben in den letzten Jahren breite Anwendung in der bioorthogonalen Chemie gefunden. Sie katalysieren die ortsspezifische Oxidation eines Cysteinrestes zur Aldehyd‐haltigen Aminosäure Cα‐Formylglycin (FGly). FGly kann in jedem beliebigen Zielprotein generiert und anschließend für bioorthogonale Konjugationsreaktionen genutzt werden. Das prototypische Formylglycin‐generierende Enzym (FGE) und das Eisen‐Schwefel‐Protein AtsB zeigen leichte Variationen in ihren Erkennungssequenzen. Spezifische Motive in Peptiden und Proteinen wurden entworfen, die selektiv von diesen Enzymen adressiert werden. Die Kombination dieser Motive innerhalb eines Peptids oder rekombinanten Proteins ermöglichte die unabhängige und sukzessive Einführung von zwei FGly‐Resten und die Generierung hetero‐difunktionalisierter Proteinkonjugate.