Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa fitness during biofilm growth and upon ceftazidime exposure

Medientyp: E-Book; Hochschulschrift

Titel: Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa fitness during biofilm growth and upon ceftazidime exposure

Beteiligte: Schinner, Silvia Anna Christina [Verfasser:in]; Steinert, Michael [Akademische:r Betreuer:in]; Häussler, Susanne [Akademische:r Betreuer:in]

Körperschaft: Technische Universität Braunschweig

Erschienen: Braunschweig: Technische Universität Braunschweig, 2021

Umfang: 1 Online-Ressource (PDF-Datei: 6 MB)

Sprache: Englisch

DOI: 10.24355/dbbs.084-202112221020-0

Identifikator:

Schlagwörter: Hochschulschrift

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, Technische Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig, 2021

Anmerkungen: Zusammenfassung in deutscher und englischer Sprache

Beschreibung: Pseudomonas aeruginosa is found in various environments and is well-known as an opportunistic human pathogen causing acute and chronic biofilm-associated infections in humans. It poses a major threat due to its ability to form biofilms, the emergence of antibiotic resistances and its virulence. We used genome-wide high-throughput transposon sequencing technology and transcriptional profiling approaches to unravel those genes, which are important to establish the two relevant phenotypes of biofilm growth and antibiotic resistance in P. aeruginosa as well as to characterize the mutual regulation of the virulence-associated gene pair lasR/rsaL. Therefore, we generated transposon insertion libraries in several P. aeruginosa strain backgrounds (laboratory strains and clinical isolates) and used Tn-Seq to quantify the fitness of all genes after either biofilm growth or after ceftazidime (CAZ) exposure. As expected, for survival under biofilm growth conditions, we show that alginate expression and the adaptation to microaerophilic growth conditions play a key role. On the other hand, transposon insertions in genes involved in motility and PQS signaling provided a higher fitness during biofilm growth. Interestingly, also unexpected cell processes were identified as important for biofilm growth, such as the involvement of the SOS response as well as several tRNA modifying enzymes. For survival under CAZ exposure, we show that in three CAZ-resistant P. aeruginosa clinical isolates, whose intrinsic β-lactamase ampC expression is not elevated, mainly expression of genes involved in the peptidoglycan recycling pathway, in biofilm formation and penicillin-binding proteins are important besides induction of ampC. However, the mechanism of induction of ampC in the isolates studied is unknown and requires further investigation along with the involvement of permease AmpG, mediating the transport of muropeptides into the cell, which seems to play a yet underestimated key role in the CAZ resistome. Our results provide new insights into the adaption of P. aeruginosa to biofilm growth conditions as well as its CAZ resistome, supporting the use of transposon insertion sequencing as a global genomic technology for understanding the establishment of difficult-to-treat P. aeruginosa infections. In the Tn-Seq analysis, we identified the quorum-sensing regulator lasR as one of the genes beneficial for biofilm growth, when knocked out and thus we wanted to characterize its regulation pattern in more detail. P. aeruginosa's biofilm formation and production of virulence factors depends highly on a functional quorum sensing system. Therefore, we evaluated whether the overlapping transcriptional regulator gene pair lasR and rsaL is involved in mutual regulatory events, such as transcriptional interference and interference by natural antisense transcripts. We introduced various gene expression constructs into a P. aeruginosa PA14 wild-type and a PA14 lasR/rsaL double deletion mutant, and found that although complementary RNA is produced, this does not interfere with the sense gene expression levels of lasR and rsaL and does not have functional consequences on down-stream gene regulation. Our data suggest that the natural gene organization including partial overlap at the 3' ends of the lasR/rsaL genes is based on a finely balanced system that prevents dominant and unilateral control of one gene over the other. ; Pseudomonas aeruginosa ist in der Lage unter verschiedenen Umweltbedingungen zu überleben und ist als opportunistischer Krankheitserreger bekannt, der akute und chronische Infektionen beim Menschen verursacht. Aufgrund seiner Fähigkeit Biofilme zu bilden mitsamt vermehrtem Auftreten von Antibiotikaresistenzen, stellt er eine große Bedrohung dar. Wir haben Transposon-Sequenzierung als genomweite Hochdurchsatztechnologie sowie Transkriptionsprofile verwendet, um diejenigen Gene zu identifizieren, die für die beiden relevanten Phänotypen Wachstum im Biofilm und Antibiotikaresistenz in P. aeruginosa wichtig sind, sowie die gegenseitige Regulation des virulenz-assoziierten Genpaares lasR/rsaL zu charakterisieren. Hierfür generierten wir Transposon-Insertionsbibliotheken in mehreren P. aeruginosa-Stamm-Hintergründen (Laborstämme und klinische Isolate) und verwendeten Tn-Seq, um die Fitness aller Gene sowohl nach Biofilm-Wachstum als auch nach Ceftazidim (CAZ)-Einfluss quantitativ zu bestimmen. Wie erwartet, zeigen wir für das Überleben unter Biofilm-Wachstumsbedingungen, dass die Expression von Alginat und die Anpassung an mikroaerophile Wachstumsbedingungen eine Schlüsselrolle spielen. Auf der anderen Seite sorgen Transposon-Insertionen in Genen, die an Motilität oder PQS-Signalisierung beteiligt sind, für eine erhöhte Fitness während des Biofilm-Wachstums. Interessanterweise wurden auch unerwartete Zellprozesse als wichtig für das Biofilm-Wachstum identifiziert, wie z. B. die Beteiligung der SOS-Gene, sowie mehrerer tRNA-modifizierender Enzyme. Für das Überleben unter CAZ-Einfluss zeigen wir, dass in drei CAZ-resistenten klinischen Isolaten von P. aeruginosa, deren intrinsische β-Laktamase ampC-Expression nicht erhöht ist, neben der Induktion von ampC vor allem Expressionen von Genen, die am Peptidoglykan-Wiederverwertungsprozess oder an Biofilmbildung beteiligt sind, sowie Penicillin-bindende Proteine wichtig sind. Der detaillierte Mechanismus der ampC-Induktion in den untersuchten Isolaten ist jedoch unbekannt und erfordert weitere Untersuchungen zusammen mit der Beteiligung der Permease AmpG, die den Transport von Muropeptiden in die Zelle vermittelt und eine bisher unterschätzte Schlüsselrolle im CAZ-Resistom zu spielen scheint. Unsere Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse für P. aeruginosa bezüglich der Anpassung an Wachstumsbedingungen im Biofilm sowie des CAZ-Resistoms. Sie führen zudem zu einem besseren Verständnis der Etablierung von schwer zu behandelnden P. aeruginosa Infektionen auf Basis der globalen Genomtechnologie Transposon-Insertionssequenzierung. In unseren Tn-Seq-Analysen haben wir den Quorum-Sensing-Regulator lasR als eines der Gene identifiziert, die für das Biofilm-Wachstum von Vorteil sind, wenn sie ausgeschaltet werden. Aus diesem Grund wollten wir sein Regulationsmuster genauer charakterisieren. Die Biofilmbildung von P. aeruginosa und die Produktion von Virulenzfaktoren hängt stark von einem funktionierenden Quorum-Sensing-System ab. Wir untersuchten, ob das überlappende Transkriptionsregulator-Genpaar lasR und rsaL einen gegenseitigen Regulationsmechanismus besitzt, wie z. B. transkriptionelle Interferenz und Interferenz durch natürliche Antisense-Transkripte. Wir brachten verschiedene Genexpressionskonstrukte in einen P. aeruginosa PA14-Wildtyp und in eine PA14 lasR/rsaL-Doppeldeletionsmutante ein und stellten fest, dass, obwohl komplementäre RNA produziert wird, diese die Sense-Genexpressionslevel von lasR und rsaL nicht beeinträchtigt und keine funktionellen Konsequenzen für downstream Gene hat. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die natürliche Genorganisation mitsamt partieller Überlappung an den 3'-Enden der lasR/rsaL-Gene auf einem fein ausbalancierten System basiert, welches eine dominante und einseitige Kontrolle des einen Gens über das andere verhindert.

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