Caracterización bioquímica y molecular de nucleósido difosfato quinasas de Solanum tuberosum (StNDPK… - SLUB Dresden

Medientyp: E-Book

Titel: Caracterización bioquímica y molecular de nucleósido difosfato quinasas de Solanum tuberosum (StNDPKs): análisis de su expresión en la planta de papa en respuesta a estreses ; Biochemical and molecular characterization of nucleoside diphosphate kinase from Solanum tuberosum (StNDPKs): analysis of its expression in the potato plant in response to stress

Beteiligte: Bachmann, Sandra D [VerfasserIn]

Erschienen: [Erscheinungsort nicht ermittelbar]: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2012

Sprache: Spanisch

Identifikator:

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2012

Anmerkungen:

Beschreibung: La capacidad de respuesta de una planta ante los cambios ambientales circundantes asegura su supervivencia. Los mecanismos de respuesta a estres biótico y abiótico están regulados por vías que dependen de la activación de genes en la cual una red de transducción de señales abarca desde la percepción de las señales hasta la expresión de genes de respuesta permitiendo la adaptación de la planta a su entorno, debiendo para ello integrar las señales externas e internas. Las nucleosido di fosfato quinasas (NDPKs) son enzimas que transfieren el fosfato γ de nucleósidos tri fosfatos (NTPs) a nucleósidos di fosfatos (NDPs) a través de un intermediario fosforilado en una histidina conservada, participando de la red de comunicación energética intracelular y pudiendo alterar el pool de NTPs. En plantas se han visto recientemente involucradas en varias cascadas de señalización. El objetivo general del trabajo es caracterizar las isoformas de NDPK en plantas de papa (S. tuberosum, var. Spunta) y estudiar su participación en la percepción de señales ambientales, analizando su expresión en respuesta a señales de estrés biótico y abiótico. La hipótesis planteada es que, dado que en toda situación de estrés subyace un compromiso energético y considerando que las NDPKs poseen actividad de fosfo-transferasa, éstas podrían estar involucradas en las respuestas a estímulos ambientales. A partir de los EST correspondientes a isoformas de NDPKs (STMED71, STMHY37) detectados en los microarreglos TIGR 10K de ARNm de brotes de papa cultivados en luz/oscuridad, se clonó de la secuencia codificante completa de StNDPK1 (GB FJ743686) a partir de brotes de papa y se sub-clonó un fragmento de la secuencia codificante de StNDPK2 (GB JF832386) a partir de una biblioteca de estolones. Se comparó la expresión de ambas en los distintos tejidos vegetativos y reproductivos de la planta y en tres estadios de tuberización por RT-PCR semi cuantitativa. StNDPK1 se expresa con distintos niveles de ARNm tanto en los tejidos como en los estadios de tuberización, mientras que StNDPK2 se expresaría en algún estadio de estolón tuberizante que no se pudo determinar. El análisis in silico de la secuencia aminoacidica de StNDPK1 muestra que tiene 238 amino ácidos de longitud, un peso molecular aproximado de 26 kDa y un punto isoeléctrico de 9.24. Codificaría para una proteína mitocondrial, el péptido señal comprendería los primeros 56 aa y el PM de la proteína madura sería de aprox. 20 kDa. La proteína recombinante StNDPK1 marcada con seis histidinas (6xHis) en su N-terminal producida se analizó por Western blot. Un anticuerpo anti-His detectó una banda de 26 kDa, mientras que un anticuerpo anti-NDPK1 dirigido contra el extremo Cterminal de la proteína reveló la banda de 26 kDa y una banda de 18kDa que podría corresponder a la proteína madura. Se detectó actividad de NDPK en extractos crudos y fracciones mitocondriales de brotación tubérculos, pero no en fracciones de cloroplastos. Además, los ensayos de Western blot realizados con el anticuerpo específico antiNDPK1 detectó la enzima en la fracción mitocondrial. El análisis filogenético de la proteína muestra que StNDPK1 está directamente emparentada con NDPK de Spinacia olaracea (que localiza en cloroplastos) y que posee un ancestro común con las otras isoformas de NDPKs de localización mitocondrial (AtNDPK3, BrNDPKIII y PsNDPK3). Además se pudo clonar la secuencia genómica completa de Stndpk1 (GB GU144806) de 3358 nts, posee 7 exones y 6 intrones. El Southern Blot usando como sonda la secuencia codificante de StNDPK1 sugiere que este gen pertenece a una familia multigénica. Por otro lado, se obtuvo el promotor de éste gen de 2385 pb cuyo análisis in silico revela la presencia de elementos regulados por luz, frío, daño mecánico, respuesta a defensa y dos sitios reguladores de los niveles transcripcionales (CAATbox y 5UTR Py-rich stretch). Dado que se disponía de mayor información respecto de la estructura del gen y de los elementos regulatorios que contiene la isoforma 1 de StNDPK y considerando que ésta tenía un perfil de expresión menos complejo que la isoforma 2, se realizaron los estudios de expresión en condiciones de estrés abiótico y biótico sólo para la isoforma 1. Los resultados de las RT-PCR semi-cuantitativas muestran que el nivel de ARNm de StNDPK1 aumenta en la exposición de plantas a oscuridad por tiempos cortos, mientras que en la exposición a bajas temperaturas se produce una disminución inicial de la expresión para luego recuperar los niveles normales. Se observó que tanto en el tratamiento con daño mecánico como el agregado de AJ (10μM) producen un aumento del mensajero de StNDPK1. Por otro lado, se midió actividad de NDPK en extractos de proteínas nativas de fracciones mitocondriales y de cloroplastos; tanto el extracto crudo, como la fracción mitocondrial presentan actividad de NDPK, sin embargo en la fracción de cloroplastos no se detectó actividad alguna. El análisis bio-informático sugiere que las dos isoformas, son de localización sub-celular. Pero en particular, StNDPK1 fue detectada por Western blot en la fracción mitocondrial donde también se midió la actividad enzimática; por lo que StNDPK1 sería una isoforma que localiza en la mitocondria. Al menos dos isoformas de NDPK en plantas de papa muestran un patrón muy diferente de expresión, StNDPK1 tiene diferentes niveles de expresión en tejidos, pero su expresión es ubicua, mientras StNDPK2 muestra un patrón más restringido y sólo se expresa en ciertas etapas de estolones, lo que sugiere que posiblemente su expresión esté asociada a ciertas etapas del desarrollo del tubérculo. Nuestros resultados sugieren fuertemente que StNDPK1 está dirigida a la mitocondria. El análisis de los datos de Stndpk1 promotor es consistente con los resultados de la expresión, lo que sugiere que StNDPK1 podrían estar involucrados en las respuestas ambientales a la disponibilidad de luz, temperaturas bajas o ataque herbívoro. ; The responsiveness of a plant to environmental changes ensures its survival. Response mechanisms to biotic and abiotic stresses are regulated by signal transduction networks that extend from signal perception to gene activation allowing the plant´s adaptation to the environment through a process that integrates external and internal signals. Nucleoside diphosphate kinases (NDPKs) participate in the intracellular energy communication network by altering the nucleoside triphosphates (NTPs) pool; they catalyze the transfer of γ phosphates from NTPs to nucleoside diphosphate (NDPs) through a phosphorylated protein intermediary at a conserved histidine. NDPKs have been involved in several signaling cascades in plants. The overall aim of this study is to characterize NDPK isoforms in potato (S. tuberosum, var. Spunta) plants and to study their involvement in the perception of environmental signals by analyzing their expression in response to biotic and abiotic stress signals. Our hypothesis is that, as in all stress situations there is an underlying commitment to energy; NDPKs could be involved in responses to environmental stimuli. ESTs from NDPKs isoforms (STMED71, STMHY37) were detected in a TIGR 10K microarray probed with total RNA from potato sprouts grown under different conditions (light/dark). StNDPK1 complete coding sequence (GB FJ743686) was cloned using total RNA from potato sprouts while a fragment of StNDPK2 coding sequence (GB JF832386) was amplified from a cDNA library from tuberizing stolons. Bioinformatic analysis suggested that both isoforms have a sub-cellular localization because they don´t have the characteristic YE motif present in cytosolic NDPKs. Phylogenetic analysis shows that StNDPK1 protein is directly akin of Spinacia olaracea NDPK (which is located in chloroplasts) and shares a common ancestor with other NDPK isoforms with mitochondrial localization (AtNDPK3, BrNDPKIII and PsNDPK3). In silico analysis of StNDPK1 sequence shows that it encodes a protein of 238 aminoacids (aa) with a molecular weight of 26 kDa and an isoelectric point of 9.24. A mitochondrial signal peptide of 56 aa was predicted, thus the mature protein would be of approx. 20 kDa. The recombinant StNDPK1protein tagged with six histidines (6xHis) in its N-terminus was produced and analyzed by Western blot. An anti-His antibody detected a 26 kDa band while an anti-NDPK1 antibody directed against the C-terminus of the protein revealed the 26 kDa band and an 18kDa band that could correspond to the mature protein. NDPK activity was detected in crude extracts and mitochondrial fractions from sprouting tubers, but not in chloroplast fractions. In addition, Western blot assays performed with the specific antiNDPK1 antibody detected the enzyme in the mitochondrial fraction. A Southern blot probed with StNDPK1 complete coding sequence suggests that this gene belongs to a multigene family. The complete genomic sequence of Stndpk1 (GB GU144806) and its promoter region (2385 bp)...

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