Antibody engineering for HIV therapeutics : from fusion inhibition to delivery of genetic regulators

Medientyp: E-Book

Titel: Antibody engineering for HIV therapeutics : from fusion inhibition to delivery of genetic regulators

Beteiligte: Santos, Ana Catarina Cunha [VerfasserIn]

Erschienen: [Erscheinungsort nicht ermittelbar]: [Verlag nicht ermittelbar], 2017

Sprache: Englisch

Identifikator:

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, 2017

Anmerkungen:

Beschreibung: Tese de doutoramento, Farmácia (Biotecnologia Farmacêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017 ; Despite latest advances on antiretroviral therapeutics, HIV infection continues to be a chronic condition with serious complications and burden costs of treatment. The rapidly emergence of resistant strains constitutes a major contributor for failure of standard therapy. Accordingly, there is a continuous need for design of innovative HIV inhibitors against conserved and important targets on virus replication cycle. On the other hand, the exploration of novel classes of HIV inhibitors results in a necessity for novel efficient and specific delivery systems. In the present thesis, we manage to target HIV infection through two distinct therapeutic approaches based on single-domain antibody (sdAb) technology. In the first one, we developed a novel fusion inhibitor of HIV by rationally engineering the binding sites of a stable light-chain scaffold from rabbit-origin. From five sdAbs with specificity to the conserved and crucial-to-fusion N36 viral sequence, one potently inhibited HIV-1 infectivity. The selected fusion inhibitor, named F63, was capable of broadly inhibiting distinct strains of HIV-1 with an antiviral potency similar to the T-20 entry inhibitor, clinically approved for HIV/AIDS treatment. Moreover, F63 presented an effective neutralization activity against HIV type 2, which constitutes an advantage relative to the limited antiviral breadth of T-20. In the second approach, we took advantage of a previously validated variable domain from camel (nanobody) to design a strategy for CXCR4-targeted delivery of HIV expression inhibitors. The engineered nanobody-based vehicle delivered an anti-HIV small interfering RNA specifically to CXCR4-bearing cells—susceptible to HIV infection—being the activity of the delivered RNAi effector proved by virus promoter silencing and inhibition of HIV replication. A second version of this construct allowed to deliver a zinc-finger transcription factor, which functionality depends on CXCR4-mediated endocytosis as mechanism of cellular crossing-over. In resume, this study demonstrates the potential of engineering single-domain antibodies for HIV therapeutics and gives insights into the design of novel antiviral drugs. ; O Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) apresenta-se como um dos principais problemas de Saúde Pública a nível mundial, tendo sido responsável por milhões de vítimas desde a sua descoberta. Esta doença é caracterizada por uma grave deterioração do sistema imunológico dos indivíduos afetados, o que resulta no aparecimento de infeções oportunistas fatais. A SIDA foi pela primeira vez descrita em 1981, em consequência da deteção em indivíduos jovens de doenças resultantes de uma imunodeficiência demarcada. Estes acontecimentos culminaram no isolamento dos agentes etiológicos da doença, o Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 e tipo 2 (HIV-1 e HIV-2 do inglês Human Immunodeficiency Virus). A síndrome causada pelo HIV-1 é mais severa e a taxa de transmissão apresentada por este tipo de vírus mais elevada. Devido a estas características, o HIV-1 constitui um alvo terapêutico preferencial relativamente ao HIV tipo 2. Apesar dos desenvolvimentos recentes na terapia antirretroviral, uma estratégia eficaz contra a infeção por HIV continua a estar indisponível, sendo o contínuo aparecimento de estirpes resistentes um dos principais obstáculos para a erradicação desta doença. Como tal, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas assim como de métodos para a sua entrega eficiente continua a constituir uma necessidade urgente na terapia desta grave doença. A engenharia de anticorpos surge como uma ferramenta importante para o desenvolvimento de novas terapias biológicas. Esta abordagem é particularmente importante no contexto da infeção por HIV devido à dificuldade em isolar anticorpos neutralizantes e com largo espectro de ação a partir de indivíduos infetados. Este facto prende-se com os diversos mecanismos de evasão imunológica apresentados pela glicoproteína viral de superfície responsável pelo processo de entrada do vírus infecioso na célula hospedeira. Entre estes destaca-se a localização de difícil acesso de sequências/regiões virais conservadas e críticas para o ciclo replicativo do vírus, que impossibilita o seu reconhecimento por anticorpos de tamanho tradicional. Neste contexto, a redução do tamanho do anticorpo para formatos pequenos, como os anticorpos de domínio único, constitui uma vantagem tremenda na ligação a estes epítopos. Os anticorpos de domínio único são apenas constituídos pelo domínio variável da cadeia leve ou pesada de um anticorpo. Estes fragmentos podem ser obtidos a partir de outros formatos de anticorpos ou selecionados a partir de bibliotecas. De entre estas, as bibliotecas sintéticas são as que permitem maior controlo sobre a sua representatividade, visto que a sua diversidade pode ser cuidadosamente estudada e inserida por engenharia genética. Por outro lado, certos anticorpos de tamanho único, como os nanobodies", permitem o uso de alvos celulares com objetivos terapêuticos devido não só ao seu tamanho reduzido, mas a propriedades favoráveis de ligação. Adicionalmente, estes fragmentos de anticorpos possuem extraordinárias características biofísicas que os tornam atrativos para diversas aplicações, nomeadamente engenharia genética para fins terapêuticos. Estes formatos em particular permitem a exploração de novas abordagens em medicina, como a entrega específica de moléculas terapêuticas. A glicoproteína Env é responsável por mediar o processo de fusão entre o vírus de HIV e a célula hospedeira, apresentando-se como um alvo terapêutico atrativo devido à sua acessibilidade na superfície da partícula viral e papel fundamental no processo de entrada. Como tal, o Capítulo II desta dissertação de doutoramento teve como objetivo desenvolver um novo inibidor de fusão da infeção por HIV através da ligação de um anticorpo de domínio único a uma zona conservada e crítica da glicoproteína Env—região N36. Para tal e baseados numa estratégia racional de desenho, construímos uma biblioteca sintética de anticorpos de domínio único usando um fragmento variável de coelho como base. As regiões de ligação ao antigénio deste fragmento foram ampliadas e modificadas de modo a tornarem-se mais flexíveis e aptas para ligar à zona extremamente côncava onde a sequência N36 se situa. A partir da biblioteca sintética foram selecionados, pela tecnologia de "phage display", cinco fragmentos de anticorpos distintos que apresentaram ligação específica ao péptido N36 e impediram a infeção pela estirpe laboratorial HIV-1 NL4-3. Um destes fragmentos, F63, apresentou uma capacidade de neutralização potente e abrangente de diversas estirpes virais primárias quer de HIV-1 como de HIV-2, em alguns casos superior ao único inibidor de fusão aprovado no mercado, T-20. Este facto poderá em parte ser explicado pelo epítopo do fragmento F63 apenas parcialmente se sobrepor à região de ligação do péptido T-20. O anticorpo de domínio único F63 apresentou ainda uma ligação específica a membranas lipídicas, uma propriedade previamente associada a outros potentes inibidores de entrada. A exploração de novas classes de inibidores antirretrovirais resulta numa necessidade crescente de desenvolver plataformas e estratégias para a sua entrega específica. Como tal, o Capítulo III da presente dissertação de doutoramento teve como objetivo a entrega específica de inibidores da expressão viral a células suscetíveis à infeção por HIV. Para tal, tomámos partido de um domínio variável de camelo ("nanobody") previamente validado para o co-recetor de HIV-1 CXCR4 e construímos uma quimera como veículo de entrega de uma pequena molécula terapêutica de RNA de interferência (siRNA do inglês small interfering RNA). Os "nanobodies" são domínios variáveis autónomos derivados de um tipo peculiar de anticorpos apenas constituídos por cadeias pesadas, existentes em alguns membros da família Camelidae. Estes formatos naturalmente apresentam características biofísicas favoráveis e aptidão para reconhecerem epítopos não-convencionais. A quimera aqui desenvolvida foi capaz de entregar especificamente o efetor de RNA de interferência a células contendo o recetor CXCR4 na sua superfície. A funcionalidade da molécula de RNA entregue por endocitose foi também comprovada pelo silenciamento do promotor de HIV e da inibição da replicação viral em células portadoras do mesmo recetor. Adicionalmente, os resultados deste capítulo revelaram a aplicação deste "nanobody" numa estratégia de funcionalidade dependente da via de entrega. Nesta abordagem alternativa, um fator de transcrição constituído por uma proteína dedos-de-zinco foi conjugado com dois "nanobodies", um que reconhece o recetor CXCR4 e outro irrelevante. Alguns destes fatores de transcrição artificiais baseados na tecnologia de proteínas dedos-de-zinc...

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