Beschreibung:
Histamin H4-Rezeptor, NIH-3T3-Zellen, ST1006. - Das Ziel dieser Dissertation war die Etablierungvon In-vitro und In-vivo-Modellen zur Untersuchung von Histaminrezeptor-Liganden in der Maus. Im ersten Teil sollten die Eigenschaften der Histaminrezeptoren H1R und H3R der Maus in rekombinanten Systemen unter vergleichbaren experimentellen Bedingungen untersucht werden. Auf diese Weise können rezeptorabhängige Unterschiede und molekulare Grundlagen von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen festgestellt werden. Voraussetzung für derartige Untersuchungen an rekombinanten Testmodellen ist die Expression des H1- und des H3-Rezeptorproteins in einer Membran, die durch Verwendung des Sf9-Zell/Baculovirus-Expressionssystems erzeugt wird. Zunächst musste die cDNA des mH1R und mH3R kodiert und in einen Baculovirus-Transfer-Vektor integriert werden. In dem verwendeten System wurde auf den Baculovirus-Transfer-Vektor pVL-1392 zugegriffen. Sf9-Zellen (von Spodoptera frugiperda) werden mit dem pVL-Plasmid und mit unvollständiger linearisierter Baculovirus-DNA co-transfiziert. Die Bindungseigenschaften der mH1R und mH3R wurden in der Radioligandenbindungsstudie mit dem Agonisten [3H] Histamin und den Antagonisten [3H] Meypramin als Radioliganden bestimmt. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Bindungsaffinität von [3H] Histamin und [3H] Meypramin am mH1R und mH3R unzureichend war. Die Affinität des mH1R und mH3R zu den Liganden konnte aufgrund der niedrigen Expressionsrate in Sf9-Zellen nicht bestimmt werden. Diese Ergebnisse bestätigen diejenigen, die bereits für den mH4R bekannt sind. Auch für mH4R war die Expressionsrate in Sf9-Zellen so gering, dass Ligandenbindungsstudien nicht möglich waren. Daher wurde ein anderes Transfektionssystem gewählt und Untersuchungen am murinen H1R und H4R durchgeführt, da diese beiden Rezeptoren am Juckreizgeschehen der Maus involviert sind. So erfolgte die Expression und Untersuchung der pharmakologischen Eigenschaften der murinen H1R und H4R unter Verwendung der NIH-3T3-Zellen als eukaryotisches Expressionssytem. NIH-3T3-Zellen wurden mit dem mH1R oder mH4R unter Verwendung der Lipofectamin 2000-Methode transfiziert. Als Voraussetzung für die weiteren Versuche wurde die erfolgreiche Transfektion des mH1R und mH4R in den NIH-3T3-Zellen zunächst mittels Western-Blot bestätigt. Außerdem wurde der Nachweis des mH4R mittels RT-PCR auf der mRNA-Ebene durchgeführt. In vitro wurde der Einfluss der H4R-Agonisten ST1006 und 4-Methylhistamin sowie Histamin und des H1R-Agonisten Pyridylethylamin auf die chemotaktische Aktivität der H1R- und H4R-transfizierten NIH-3T3-Zellen untersucht. Sowohl ST1006 als auch 4-Methylhistamin führten zu einer signifikant gesteigerten Migration von H4R-transfizierten NIH-3T3-Zellen. Die Hemmung der Migration durch JNJ7777120 spricht für eine hauptsächliche Beteiligung des mH4R an der Migration. Der H1R-Agonist Pyridylethylamin führte dagegen zu einer gesteigerten Migration von H1R-transfizierten NIH-3T3-Zellen. In vivo wurde die Wirkung der ...