Interaktion primärer intestinaler Epithelzellen des Huhns mit niedrigpathogenem aviären Influenzavirus und velogenem viszerotropen Newcastle disease Virus

Medientyp: E-Book; Hochschulschrift

Titel: Interaktion primärer intestinaler Epithelzellen des Huhns mit niedrigpathogenem aviären Influenzavirus und velogenem viszerotropen Newcastle disease Virus

Beteiligte: Kaiser, Annette Julia [VerfasserIn]; Rautenschlein, Silke [AkademischeR BetreuerIn]

Erschienen: Hannover: Tierärztliche Hochschule Hannover, 2016

Umfang: 1 Online-Ressource (II, I, 176 Seiten, 6.097 KB)

Sprache: Deutsch

Identifikator:

Schlagwörter: Vogelgrippe > Newcastle-Krankheit > Darmschleimhaut > Huhn

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, Tierärztliche Hochschule Hannover, 2016

Anmerkungen: Zusammenfassungen in deutscher und englischer Sprache

Beschreibung: Sowohl aviäre Influenzaviren (AIV) als auch Newcastle disease Viren (NDV) sind weltweit eine große Bedrohung für die Geflügelindustrie. Beide können eine schwere klinische Erkrankung, assoziiert mit einer hohen Mortalitätsrate, hervorrufen. Respiratorische Epithelzellen erwiesen sich als primäre Zielzellen für die Infektion und Replikation beider Viren. Die meisten AIV- und NDV-in vitro Studien haben sich auf Organkulturen des Respirationstraktes fokussiert, während Informationen bezüglich einer Virus-Wirt-Interaktion mit intestinalen Epithelzellen weitestgehend fehlen, obwohl Hinweise für einen Tropismus beider Viren für intestinale Epithelzellen (IECs) vorliegen. Bis heute sind nur wenige Studien zur Etablierung primärer Hühner-IECs vorhanden. Zudem sind diese Protokolle sehr unterschiedlich und wiederholbare Ergebnisse schwierig zu erlangen. Aus diesem Grund war das erste Ziel der Studie, ein geeignetes, primäres Hühner-IEC-Modell zu etablieren. Mittels eines IEC-Scoring Systems verglichen wir einige publizierte IEC-Isolationsprotokolle, den Einfluss des Alters der Tiere, des Genotyps, der Inkubationstemperatur und der Zusammensetzung des Kulturmediums auf die Adhäsion und Proliferation primärer IECs. Eine Isolation primärer IECs aus Hühnerembryonen am 20. Tag der Entwicklung führte zu einem niedrigeren Adhäsions- und Proliferations-Score verglichen mit der Isolation primärer IECs aus fünf bis 12 Wochen alten spezifisch-pathogen-freien (SPF) Hühnern des Legetyps. Darüber hinaus wurde die Adhäsion und Proliferation primärer IECs von SPF-Legehühnern mit primären IECs verglichen, die aus Broilern isoliert wurden. Obwohl der durchschnittliche Score von Broiler-IECs höher war als der durchschnittliche Score von SPF-IECs, wurden für die weitere Isolation SPF-Legehühner verwendet. Eine starke Mukusproduktion während der Isolation von Broiler-IECs führte zu bakterieller Kontamination und zu Schwierigkeiten in der Trennung des Mukus vom Zellmaterial. Des Weiteren untersuchten wir den Einfluss zweier Inkubationstemperaturen (37°C und 41°C) auf die IEC-Kultur. Eine höhere Inkubationstemperatur führte zu einer schlechteren Adhäsion und Proliferation und zu Anzeichen zellulären Stresses (z.B. eine erhöhte Vakuolenanzahl im Zytoplasma). Zusätzlich wurde der Einfluss verschiedener Zusätze und Konzentrationen zum Kulturmedium untersucht. Primäre Hühner-IECs, die mit fetalem Rinderserum anstelle von Hühnerserum kultiviert wurden, zeigten eine bessere Adhäsion und Proliferation. Das Hinzufügen von Hühnerembryoextrakt führte zu einer verminderten Anzahl adhärierender und proliferierender IEC-Cluster. Supplementierung des Kulturmediums für primäre Hühner-IECs mit Insulin, Fibronectin und Transferrin in Kombination mit der Verwendung industriell beschichteter Kollagen-Zellkulturplatten führte zu einer erfolgreichen und wiederholbaren Adhäsion und Proliferation primärer Hühner-IECs. Die Notwendigkeit einer Supplementierung dieser Komponenten demonstriert den hohen Anspruch primärer in vitro Zellkulturen epithelialer Herkunft. Der epitheliale Charakter primärer Zellkulturen wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung des Zytokeratins bestätigt, welches ein intrazytoplasmatisches Zytoskelettprotein epithelialer Zellen ist. Außerdem wurde das transmembrane Protein E-Cadherin (epitheliales Cadherin), welches zur Gruppe der Adherens Junctions gehört, mit Hilfe der Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen. Über die Transmissionselektronenmikrsokpie (TEM) konnten wir zusätzliche IEC-Charakteristika wie Mikrovilli und Tight Junctions nachweisen. Im zweiten Teil der Studie wurde in vitro die Virus-Wirt-Interaktion zwischen einem niedrigpathogenen AIV (LPAIV) und velogenen viszerotropen NDV (vvNDV) mit primären Hühner-IECs untersucht. Dabei wurden die Replikationsdynamik und mRNS-Expression von Typ I und Typ III Interferonen (IFNs) nach einer Infektion mit niedrigpathogenem AIV (LPAIV) und velogenem viszerotropen NDV (vvNDV) sowie das mRNS-Expressionsmuster der IFN regulierten Gene (IRGs) IFIT 5 (IFN-induced protein with tetratricopeptide repeat 5) und ISG12 (IFN-stimulated gene 12) vier, 16 und 24 Stunden nach Infektion (hours post infection, hpi) näher untersucht. Als Vergleich zu einigen untersuchten Parametern wurden primäre Hühnerembryofibroblastkulturen (CEFs) eingesetzt. IECs und CEFs wurden mit einer niedrigen infektiösen Dosis (LID; Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01) oder hohen infektiösen Dosis (HID; MOI von 1) LPAIV H9N2 oder vvNDV Herts 33/56 infiziert. Unsere Ergebnisse zeigten eine hohe Empfänglichkeit primärer Hühner-IECs gegenüber den in dieser Studie verwendeten LPAIV- und vvNDV-Stämmen. Virusreplikationsraten wurden mit Hilfe des Fokus Forming Unit- (FFU) und des Tissue Culture Infectious Dose 50- (TCID50) Tests bestimmt und zeigten einen klaren Unterschied zwischen LPAIV und vvNDV. Ein über 30-facher Anstieg der IFN-λ Expression nach einer Infektion primärer IECs mit LPAIV und vvNDV konnte beobachtet werden, während die Typ-I IFN mRNS-Expression nur leicht erhöht oder herunterreguliert war. 24 Stunden nach LPAIV-Infektion zeigte sich im Vergleich mit virusfreien Kontrollen eine bis zu 10-fache Veränderung der IFN-β mRNS-Expression. Dies deutet darauf hin, dass IFN-λ möglicherweise eine Rolle bei der Regulation von Viren in intestinalen Epithelzellen spielt. Die IRG-Expressionsmuster von IFIT5 und ISG12 nach einer LPAIV- und vvNDV-Infektion wiesen Unterschiede auf. IFIT5 und ISG12 waren nach einer LPAIV-Infektion primärer Hühner-IECs dosis- und zeitabhängig hochreguliert. Dahingegen war IFIT5 nach einer vvNDV-Infektion primärer Hühner-IECs nur leicht hochreguliert, während ISG12 herunterreguliert war. Dies deutet auf Unterschiede in der nachgeschalteten Regulierung der antiviralen Immunantwort zwischen beiden Viren hin. Insgesamt wurde in dieser Studie eine reproduzierbare Methode für die Isolierung primärer Hühner-IECs etabliert, welche sich als geeignet für die Untersuchung bestimmter Aspekte einer AIV- und NDV-IEC Interaktion erwies. Zukünftig kann diese Isolationsmethode auch für die Isolation primärer IECs aus anderen aviären Spezies verwendet werden, um die Epidemiologie und Pathogenese dieser wichtigen Viren besser zu verstehen, aber auch um andere enterale Pathogene der Vögel in ihrer Interaktion mit IECs zu untersuchen.

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