Crystallographic characterization of multiheme enzymes: cytochrome c nitrite reductase from Campylob… - SLUB Dresden

Medientyp: E-Book; Hochschulschrift

Titel: Crystallographic characterization of multiheme enzymes: cytochrome c nitrite reductase from Campylobacter jejuni and octaheme sulfite reductase from Wolinella succinogenes

Weitere Titel: Kristallographische Charakterisierung von Multihäm-Enzymen: Cytochrom c Nitrit Reduktase aus Campylobacter jejuni und Oktahäm Sulfit Reduktase aus Wolinella succinogenes

Beteiligte: Hermann, Bianca [Verfasser:in]; Einsle, Oliver [Akademische:r Betreuer:in]

Erschienen: Freiburg: Universität, 2015

Umfang: Online-Ressource

Sprache: Englisch

Identifikator:

Schlagwörter: Sulfite ; Kristallographie ; Proteine ; Online-Ressource ; Cytochrome C ; Nitrit Reduktase ; Sulfit Reduktase ; Proteinkristallographie ; Multihäm Enzyme ; Kupferprotein ; multiheme ; cytochrome c ; sulfite reductase ; nitrite reductase ; copper protein ; (local)doctoralThesis ; Hochschulschrift

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, Universität Freiburg, 2014

Anmerkungen:

Beschreibung: Zusammenfassung: The family of multiheme cytochromes c (MCC) comprises diverse electron carriers and redox enzymes that play key roles in several metabolic pathways, particularly in the nitrogen and sulfur cycle. MCCs have been shown to have a broad substrate spectrum including the six-electron reductions of nitrite to ammonia and sulfite to sulfide as well as the oxidation of hydroxylamine. In the course of this study, the crystal structures of two members of this family were solved, by means of single wavelength anomalous diffraction, and some of their spectroscopical and biochemical characteristics were investigated. CcNir from C. jejuni is a cytochrome c nitrite reductase with a conventional CxxCH binding motif for the active site, where in the majority of organisms a CxxCK motif together with a dedicated maturation machinery is conserved. The crystal structure at 1.7 Å revealed a homodimeric structure with three calcium sites per monomer. It is reminiscent of earlier ccNir structures from different organisms but with a novel N-terminal fold blocking the substrate exit channel. The active site heme iron is coordinated by the CxxCH histidine in a Ne2-Fe distance of 2.2 Å, corresponding the regular distance for heme histidine ligands, and in similar distance and position as the CxxCK lysine Ne in conventional ccNirs. Two additonal structures with the substrates nitrite and sulfite bound to the active site were solved, and EPR measurements elucidating temperature- and power-dependencies of EPR signals of the enzyme were performed. MccA from W. succinogenes is an octaheme cytochrome c sulfite reductase, known to have a substantially higher catalytic activiy than siroheme-containing sulfite reductases. The crystal structure at 2.2 Å represents the first crystal structure of this type of multiheme enzymes, revealing an unprecedented homotrimeric fold and a novel arrangement of a conserved multiheme packing motif, including a heme c bound to an uncanonical Cx15CH binding motif. The active site was found to be a heterobimetallic center, with a Cu(I) ion juxtaposed to a heme c. MccA was purified either under presence of air, or under full exclusion of dioxygen. The difference in the copper content of both preparations as well as differences in the respective electron density lead to the conclusion that the linear S-Cu(I)-S bond between the two conserved cysteins is labile to oxidation and the metal is lost from the enzyme during this process. The copper deficient species also showed lower activity towards substrate reduction. Intact MccA was found to tightly bind SO2, a dehydration product of the substrate sulfite at the active site. SO2 was partially turned over due to photoreduction by X-ray irridation, yielding the reaction intermediate SO,providing a sound mechanistic outline for the reaction mechanism of the enzyme

Zusammenfassung: Die Familie der Multihämproteine beinhaltet verschiedenste Arten von Elektronen-überträgerproteinen und Redoxenzymen, welche vor allem im Stickstoffkreislauf, aber auch im Schwefelkreislauf zu finden sind. Eine besondere Eigenschaften von Multihäm-Redoxenzymen ist ihre Substratvielfalt. Einige von ihnen sind in der Lage die sechs-Elektronen Reduktion von sowohl Nitrit zu Ammonium, als auch von Sulfit zu Sulfid zu katalysieren. Im Laufe dieser Arbeit wurden die Kristallstrukturen von zwei Multihämproteinen gelöst und einige ihrer biochemischen und spektroskopischen Charakteristika untersucht. CcNir aus C. jejuni ist eine Cytochrom c Nitrit Reduktase, die sich durch eine Besonderheit von anderen Nitrit Reduktasen dieser Familie unterscheidet. Anstelle des weit verbreiteten CxxCK Motivs zur Bindung des Aktivzentrums, hat Cj ccNir ein reguläres CxxCH Motiv. Die Kristallstruktur mit einer Auflösung von 1,7 Å zeigt ein Homodimer, dessen Tertiärstruktur bisher gelösten Strukturen aus anderen Organismen stark ähnelt. Die größten Unterschiede finden sich jedoch im C-Terminus, dessen neuartige Struktur den Ausgang des Substratkanals blockiert. Die Hämgruppe des Aktivzentrums ist durch ein reguläres CxxCH-Motiv gebunden, mit Histidin als proximalen Liganden. Dabei ist der e2 Stickstoff des Imidazolrings in derselben Position und mit 2,2 Å in ähnlichem Abstand, wie der Lysin-Stickstoff im weiter verbreiteten CxxCK-Motif. Im Verlauf dieser Arbeit wurden des weiteren die Bindungsmodi der Substrate Nitrit und Sulfit am Aktivzentrum kristallographisch bestimmt, sowie die Leistungs- und Temperaturabhängigkeit verschiedener Gruppen von Signalen im Cj ccNir EPR-Spektrum untersucht. MccA aus W. succinogenes is eine Cytochrom c Sulfite Reduktase. Die Kristallstruktur, welche im Zuge dieser Arbeit mit einer Auflösung von 2,2 Å gelöst wurde, repräsentiert die erste Struktur dieser Enzymklasse. MccA bildet eine Homotrimer, welches eine neuartige Anordung der Monomere und damit einhergehend die Organisation der drei Oktahäm-Motive zueinander, ausbildet. Häm 8 ist dabei an ein ungewöhnliches Cx15CH-Motif gebunden. Eine Besonderheit des Aktivzentrums ist die Präsenz eines Cu(I) Ions, welches linear von zwei Cysteinen in umittelbarer Nähe zur Hämgruppe koordiniert ist und damit eine neuartiges Kupfer/Häm-Zentrum ausbildet. MccA wurde parallel an Luft und unter Sauerstoffausschluß gereinigt. Unterschiede des Kupfergehalts beider Reinigungen, sowie Unterschiede in der Elektronendichte um das Aktivzentrum beider Präparationen führten zu dem Schluß, das die S-Cu(I)-S Bindung leicht an Luft oxidiert wird, was den Verlust des Kupferions zur Folge hat. Der Verlust geht einher mit einer Abnahme an Aktivität. Intaktes MccA bindet Intermediate der Sulfitreduktion, SO2 und SO, fest im Aktivzentrum. Aus den Strukturen dieser Substrataddukte wurde ein plausibler Reaktionsmechanismus der Reduktion von Sulfit zu Sulfid hergeleitet

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