Beschreibung:
Abstract: Transcription factor EBF1 (early B-cell factor 1) acts as a key regulator of B cell differentiation in hematopoietic progenitors by activating B cell-specific genes and repressing genes associated with alternative lineage potential. The transcriptional network in which EBF1 acts has been extensively studied, however, the regulation of EBF1 function remains poorly defined. To identify proteins that modulate the diverse function of EBF1, our lab has previously performed SILAC-based mass spectrometry of proteins associated with endogenous EBF1 in pro-B cells. Among the highest enriched proteins was the nuclear import receptor Transportin-3 (Tnpo3). Preliminary results showed that EBF1 interacts with Tnpo3 via specific residues in the EBF1 IPT domain. One aim of this study was to elucidate the significance of Tnpo3 for the function of EBF1. Complementation of Ebf1-/- progenitors with EBF1 carrying mutations in Tnpo3-interacting residues allowed for normal generation of CD19+ pro-B cells in co-culture with OP9 feeders but impaired B-lineage differentiation in co-cultures with T cell-promoting OP9-DL1 feeders. This defect was rescued by the addition of a gamma secretase inhibitor, suggesting that Tnpo3 is required for EBF1 to antagonize the effects of Notch signaling. The EBF1 mutations that abrogate the interaction with Tnpo3 did not affect the nuclear localization of EBF1, implying a role of Tnpo3 for EBF1 function independent of its nuclear import. These observations suggest that Tnpo3 preserves the function of EBF1 in B cell programming under non-permissive conditions. To explore further mechanisms that regulate the function of EBF1, a second aim of this study was to investigate whether EBF1 function is controlled by interacting RNA. Using a protein- RNA immunoprecipitation approach followed by Next Generation Sequencing, potential RNA interaction partners of EBF1 in pro-B cells were determined
Abstract: Transkriptionsfaktor EBF1 (early B-cell factor 1) ist ein Schlüsselfaktor für die Entwicklung von B-Zellen im Immunsystem. Er aktiviert B-Zell-spezifische Gene in hämatopoetischen Vorläuferzellen und reprimiert Gene, die alternative Zellschicksale festlegen. Die genregulatorischen Netzwerke, in denen EBF1 agiert, wurden intensiv untersucht, jedoch bleibt unklar, welche molekularen Mechanismen die Funktion von EBF1 steuern. Um diese zu verstehen, hat unser Labor mittels SILAC-basierter Massenspektrometrie Interaktionspartner von EBF1 in pro-B Zellen identifiziert. Einer der am stärksten angereicherten Interaktionspartner war der nukleäre Importrezeptor Transportin-3 (Tnpo3). Vorläufige Ergebnisse haben gezeigt, dass Tnpo3 mit bestimmten Aminosäureresten in der EBF1 IPT Domäne interagiert. Ein Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Tnpo3 auf die Funktion von EBF1 zu untersuchen. Expression von mutantem EBF1 in Ebf1-/- Vorläuferzellen, welches Mutationen in den Tnpo3-interagierenden Resten trägt, und anschließende Co-Kultivierung auf OP9 Fütterzellen führte zu einer normalen Entwicklung in CD19+ pro-B Zellen, während Co-Kultivierung auf T-Zell-spezifischen OP9-DL1 Fütterzellen in einer partiellen Blockade der B-Zell-Differenzierung resultierte. Diese Blockade wurde durch Zugabe eines Gamma-Sekretase-Inhibitors verhindert, was zeigt, dass Tnpo3 für eine antagonistische Wirkung von EBF1 auf Notch-vermittelte Signale wichtig ist. Die EBF1-Mutation, die die Interaktion mit Tnpo3 verhindert, hatte keinen Einfluss auf die intrazelluläre Lokalisation von EBF1, was belegt, dass die Rolle von Tnpo3 für die Funktion von EBF1 unabhängig von seiner Funktion als Importrezeptor ist. Die hier erlangten Ergebnisse zeigen, dass Tnpo3 die Funktion von EBF1 während der B-Zell-Entwicklung unterstützt und somit ein wichtiger Regulator für dessen Funktion ist. Um weitere Mechanismen zu untersuchen, die die Funktion von EBF1 regulieren, wurde als zweites Ziel dieser Arbeit potentielle Interaktion von EBF1 mit RNA untersucht. Mittels protein-RNA Immunpräzipitation und Next Generation Sequencing wurden potentielle RNA Interaktionspartner von EBF1 in pro-B Zellen ermittelt