Impact of cations and degree of phosphorylation on structural transition and aggregation processes of phosvitin

Medientyp: E-Book

Titel: Impact of cations and degree of phosphorylation on structural transition and aggregation processes of phosvitin

Beteiligte: Betschart, Martin [Verfasser:in]; Müller, Michael [Akademische:r Betreuer:in]; Lüdeke, Steffen [Sonstige Person, Familie und Körperschaft]; Shastri, V. Prasad [Sonstige Person, Familie und Körperschaft]

Körperschaft: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Institut für Pharmazeutische Wissenschaften ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Erschienen: Freiburg: Universität, 2023

Umfang: Online-Ressource

Sprache: Englisch

DOI: 10.6094/UNIFR/233141

Identifikator:

Schlagwörter: Proteine ; Proteinfaltung ; Strukturaufklärung ; CD-Spektroskopie ; Phosvitin ; Multivariate Analyse ; (local)doctoralThesis

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, Universität Freiburg, 2022

Anmerkungen:

Beschreibung: Abstract: Phosvitin, a hyperphosphorylated protein from hen egg yolk, is a prototypical intrinsically disordered protein. Without an external stimulus, it lacks domains with consecutive order, such as α-helix or β-sheet. However, at low pH, the numerous phosphate groups are protonated, and the ionic interactions are reduced, it undergoes a structural transition from disordered structure to β-sheet. It is assumed that this transition impacts its physiological function as a biomineralization protein. The structural change of phosvitin was studied by electronic circular dichroism (CD) spectroscopy. CD spectra were measured over a broad pH range, each spectrum represents a structural equilibrium of phosvitin at a given pH. The data were analyzed by matrix least-square (MLS) global fitting to identify the transition pK of the structural transition and the species involved in the transition by interpreting the spectra obtained from the fitting amplitudes. As equilibration at low pH did not occur instantaneously but was associated with slow time-dependent spectral changes, the transition from PII− disordered structure to β-sheet was also monitored by CD spectroscopy over time after a fast decrease of pH to 1.90. Astonishingly, the time constant found from MLS global fitting assuming a first-order kinetic (τ = 1.1 h) was much longer than expected for a secondary structure transition, which suggests an aggregation process to be involved in the slow transition process. This hypothesis was supported by dynamic light scattering (DLS) experiments, showing an increase of scattered light with a similar time constant as the spectral changes observed in the CD. As ionic interactions were identified as the putative driver of pH-dependent structural changes in phosvitin, the impact of different cations on the transitions was tested under similar conditions. While sodium (50 mM) decelerates the described time-dependent transition at low pH, the transition is completely blocked after adding iron or aluminum at concentrations above 0.5 mM. Interestingly, the time-dependent changes in the CD and DLS experiments indicate a two-stage transition in the presence of the divalent cations calcium (5 mM) and magnesium (25 mM). Here, the intermediate component of the CD MLS global-fitting corresponds to β sheet, albeit with a slight red shift of the typical minimum at 217 nm to 220 nm. This could be explained by contributions from differential scattering, which agrees with the formation of larger aggregates in the presence of divalent cations, as indicated by DLS. In summary, the aggregation process of phosvitin depends on the concentration of cations and their valency, with an enhanced aggregation with divalent salts at low pH and a pH-independent aggregation with trivalent salts. A similar observation was made after manipulating phosvitin surface charge by dephosphorylation through phosphatase or alkaline hydrolysis. CD spectra of dephosphorylated phosvitin at low pH exhibit far less β-sheet character than observed for native phosvitin, and time-dependent experiments revealed a much slower transition. While the pK transition/aggregation was increased for variants obtained from enzymatic dephosphorylation, alkaline phosphate hydrolysis led to a lower pK. This can be explained by the high time constant of the structural transition (15.4 h) found for PV after alkaline phosphate hydrolysis. The equilibrium between the expected structures is established after several hours. Under these conditions, the observed pK value is shifted towards the acidic range, as the final transition state is not reached during the time frame of the pH titration. The results agree with the results obtained with native phosvitin in the presence of 50 mM sodium chloride (pK 1.3, τ = 11.6 h). Here, the high salt concentration strongly limits the intramolecular ionic interactions of the phosvitin phosphates. In alkaline phosphate-hydrolyzed phosvitin, these are also strongly reduced. In summary, the distribution of surface charge and the location of charged groups in phosvitin seem to control coupled secondary structure transition/self-aggregation processes in this protein. Similar concepts could apply to other proteins and other types of posttranslational modifications. For example, in alpha-1-acid glycoproteins, at neutral pH, the CD spectra of the native protein are very similar to the one of enzymatically N-deglycosylated protein. In contrast, deglycosylated protein shows a structural transition at a low pH, while the native protein aggregates into a stable secondary structure

Abstract: Phosvitin ist ein hyperphosphoryliertes Protein, welches im Eigelb von Hühnereiern gefunden wird. Es ist exemplarisch für intrinsisch ungeordnete Proteine. Diese weisen ohne äusseren Anreiz keine Domänen mit konsekutiver Ordnung wie α-Helix oder β-Faltblatt auf. Bei einem niedrigen pH-Wert werden die zahlreichen Phosphatgruppen protoniert und die ionischen Wechselwirkungen reduziert. So kommt es zu einem strukturellen Übergang von einer ungeordneten Struktur zu einem β-Faltblatt. Es wird angenommen, dass dieser Übergang die physiologische Funktion von Phosvitin als Biomineralisierungsprotein beeinflusst. In dieser Arbeit wurde die strukturelle Veränderung von Phosvitin mittels elektronischer Circulardichroismus-Spektroskopie (CD) untersucht. Die CD-Spektren wurden über einen breiten pH-Bereich gemessen, wobei jedes Spektrum ein strukturelles Gleichgewicht von Phosvitin bei einem definierten pH-Wert darstellt. Die Daten wurden mit Hilfe eines globalen Matrix-Least-Square-Fittings (Matrix least-square, MLS) analysiert, um den pK-Wert des strukturellen Übergangs zu ermitteln. Im gleichen Zug wurden die am Übergang beteiligten Spezies anhand der aus den Fitting Amplituden gewonnenen Spektren berechnet. Das Gleichgewicht bei niedrigem pH-Wert trat nicht sofort ein, sondern mit einer langsamen, zeitabhängigen spektralen Veränderung. Dieser zeitabhängige Übergang von der ungeordneten PII−Struktur zum β-Faltblatt nach einer schnellen Senkung des pH-Werts auf 1.90 konnte mittels CD-Spektroskopie beobachtet werden. Erstaunlicherweise war die Zeitkonstante, die aus dem globalen MLS-Fitting unter Annahme einer Kinetik erster Ordnung (τ = 1.1 h) ermittelt wurde, viel länger, als für einen Sekundärstrukturübergang zu erwarten wäre. Dies lässt darauf schließen, dass ein Aggregationsprozess an dem beobachteten langsamen Prozesse beteiligt ist. Diese Hypothese wurde durch Experimente mit dynamischen Lichtstreuung (DLS) bestätigt. Die beobachtete Zunahme des gestreuten Lichts wies eine ähnlichen Zeitkonstante auf, wie die mittels CD-Spektroskopie beobachteten spektralen Veränderungen. Ionische Wechselwirkungen wurden als mutmaßlicher Auslöser der pH-abhängigen Strukturveränderungen in Phosvitin identifiziert. Deshalb wurden die Auswirkungen verschiedener Kationen auf die Übergänge unter ähnlichen Bedingungen getestet. Während Natrium (50 mM) den beschriebenen zeitabhängigen Übergang bei niedrigem pH-Wert verlangsamt, wird der Übergang nach der Zugabe von Eisen(III)- oder Aluminium(III)-Chlorid bei Konzentrationen über 0.5 mM vollständig blockiert. Interessanterweise zeigen die zeitabhängigen Veränderungen in den CD- und DLS-Experimenten in Gegenwart der zweiwertigen Kationen Calcium (5 mM) und Magnesium (25 mM) einen zweistufigen Übergang auf. Dabei entspricht die mittlere Komponente aus dem CD MLS-Fitting dem β Faltblatt, wenn auch mit einer leichten Rotverschiebung des typischen Minimums bei 217 nm zu 220 nm. DLS Messungen zeigten, dass grösserer Aggregate in Gegenwart zweiwertiger Kationen entstehen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Aggregationsprozess von Phosvitin von der Konzentration der Kationen und ihrer Wertigkeit abhängt, wobei die Aggregation mit zweiwertigen Salzen bei niedrigem pH-Wert verstärkt wird und mit dreiwertigen Salzen pH-unabhängig ist. Ein ähnliches Bild ergab sich nach der Manipulation der Oberflächenladung von Phosvitin durch Dephosphorylierung mittels Phosphatase oder alkalischer Hydrolyse. Die CD-Spektren von dephosphoryliertem Phosvitin bei niedrigem pH-Wert zeigen weit weniger Charakter eines β-Faltblatts als bei nativem Phosvitin. Zudem ergaben die zeitabhängigen Experimente einen viel langsameren Übergang. Während der Übergangs-pK bei enzymatisch dephosphoryliertem Phosvitin erhöht war, führte die alkalische Phosphathydrolyse zu einem niedrigeren pK. Dies lässt sich durch die hohe Zeitkonstante des Strukturübergangs (15.4 h) erklären, welche für PV nach alkalischer Phosphathydrolyse gemessen wurde. Unter diesen Bedingungen stellt sich das Gleichgewicht zwischen den erwarteten Strukturen erst nach mehreren Stunden ein. Unter diesen Bedingungen ist der beobachtete pK-Wert in den sauren Bereich verschoben, da der Endzustand der Übergänge während der Zeitspanne der pH-Titration nicht erreicht wird. Die Ergebnisse stimmen gut mit den Resultaten von nativem Phosvitin in Gegenwart von 50 mM Natriumchlorid (pK 1.3, τ = 11.6 h) überein. In diesem Fall sind die intramolekularen ionischen Wechselwirkungen der Phosvitinphosphate durch die hohe Salzkonzentration stark eingeschränkt. Bei Phosvitin, welches alkalisch dephosphoryliert wurde, sind diese ebenfalls stark reduziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verteilung der Oberflächenladung und die Lage der geladenen Gruppen in Phosvitin die Sekundärstrukturübergänge beziehungsweise Selbstaggregationsprozesse in diesem Protein zu steuern scheinen. Ähnliche Konzepte könnten auch für andere Proteine und andere Arten von posttranslationalen Modifikationen gelten. Ein Beispiel ist das Alpha-1-Acide-Glykoproteins, dessen CD Sprektren des nativen Proteins bei neutralem pH-Wert sehr ähnlich zu den CD-Spektren von enzymatisch N-deglykosylierten sind. Wird der pH einer Lösung des deglykosylierten Proteins gesenkt, zeigt sich ein pH abhängiger Strukturübergang. Im Gegensatz dazu neigt das native Protein in einer stabilen Sekundärstruktur zu aggregieren

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