Struktur und Funktion der Ubichinol:Sauerstoff Cytochrom bd-II Oxidoreduktase aus Escherichia coli

Medientyp: E-Book

Titel: Struktur und Funktion der Ubichinol:Sauerstoff Cytochrom bd-II Oxidoreduktase aus Escherichia coli

Beteiligte: Kägi, Jan [Verfasser]; Friedrich, Thorsten [Akademischer Betreuer]; Friedrich, Thorsten [GutachterIn]; Einsle, Oliver [GutachterIn]

Körperschaft: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Institut für Biochemie ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Erschienen: Freiburg: Universität, 2023

Umfang: Online-Ressource

Sprache: Deutsch

DOI: 10.6094/UNIFR/240218

Identifikator:

Schlagwörter: Cytochromoxidase ; Escherichia coli ; FT-IR-Spektroskopie ; Oxidasen ; Rhodobacter sphaeroides ; Struktur-Aktivitäts-Beziehung ; Inhibitor ; (local)doctoralThesis

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, Universität Freiburg, 2023

Anmerkungen:

Beschreibung: Abstract: Die aerobe Atmung ist für Escherichia coli in Gegenwart von Sauerstoff von wesentlicher Bedeutung für die Erzeugung von ATP. E. coli besitzt zwei Ubichinol:Sauerstoff Cytochrom bd Oxidoreduktasen (bd-I und bd-II Oxidase), die als terminale Oxidasen Teil der Atmungskette sind. Diese beiden Enzyme reduzieren molekularen Sauerstoff zu Wasser und arbeiten unter (sehr) sauerstoffarmen Bedingungen. Hierfür weisen die bd Oxidasen eine hohe Affinität gegenüber Sauerstoff auf. Durch einen an diese Redoxreaktion gekoppelten vektoriellen Transport von Protonen über die Membran tragen die bd Oxidasen zum Aufbau der protonenmotorischen Kraft bei, die für die Erzeugung von ATP benötigt wird. Die Familie der bd Oxidasen kommt ausschließlich in Prokaryoten vor und spielt auch in Krankheitserregern wie Mycobacterium tuberculosis und Shigella flexneri durch ihre Fähigkeit zum Abbau von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies eine wichtige Rolle bei der Besiedlung eines Wirtsorganismus. Die bd Oxidasen sind deswegen zu einem sehr vielversprechenden Ziel für die Entwicklung von neuartigen Antibiotika geworden. Als Grundlage hierfür sind Kenntnisse über die Struktur und den Reaktionsmechanismus notwendig. Bis heute ist außerdem nicht geklärt, warum E. coli zwei verschiedene bd Oxidasen besitzt. Um dieser Frage näher zu kommen, wurde in dieser Arbeit die Struktur der E.-coli-bd-II Oxidase gelöst und durch gezielte Mutationen die Unterschiede zwischen den beiden bd Oxidasen untersucht. Zur Strukturbestimmung der bd-II Oxidase wurden als erstes die für die bd-II Oxidase codierenden Gene appCBX in den pET28b(+)-Vektor kloniert und ein Histidin-Tag am C Terminus von AppC bzw. AppB angefügt. Die bd-II Oxidase wurde in dem E. coli Stamm BL21*(DE3) ΔcyoA-D überproduziert und mittels Lauryl Maltose Neopentyl Glycol (LMNG) aus den Membranen solubilisiert. Im Anschluss wurde eine Präparation entwickelt, um eine möglichst reine Form der bd-II Oxidase zu erhalten. Für die Strukturlösung mittels Kryo-Elektronenmikroskopie wurde das Detergenz LMNG durch das amphiphatische Tensid Amphipol A8-35 ersetzt. Die bd-II Oxidase wurde anschließend in Zusammenarbeit mit Dr. Tim Rassmussen und Prof. Dr. Bettina Böttcher am Rudolf-Virchow-Zentrum der Julius-Maximilians-Universität Würzburg vermessen. Die Struktur wurde von Antonia Grauel im Rahmen ihrer Masterarbeit mit einer Auflösung von 3,0 Å gelöst. Wie bereits durch die hohe Sequenzähnlichkeit vermutet, zeigt die bd-II Oxidase eine sehr große strukturelle Ähnlichkeit zur bd-I Oxidase. Im Gegensatz zur bd-I Oxidase bildet die bd-II Oxidase in vitro durch eine Art „Leucin-Zipper“ neben Monomeren auch Dimere aus. Des Weiteren fehlt der bd-II Oxidase eine Homolog zur vierten Untereinheit der bd-I Oxidase, was zur Folge hat, dass der Kofaktor Häm b595 von der Membran aus zugänglich wird. Durch die Ausbildung eines Häm d-Cyanokomplexes wurde jedoch eindeutig belegt, dass das Häm d das aktive Zentrum ist. Weiterhin wurde der „Q-Loop“, ein Strukturmotiv für die Substratbindung, zum ersten Mal strukturell vollständig aufgelöst. Ermöglicht wurde dies durch Zugabe des Inhibitors Aurachin D, der in den Kryo-EM Modellen ebenfalls modelliert wurde. Dies ermöglichte die genaue Positionierung der bis dahin unbekannten Chinol-Bindestelle. Zur Untersuchung von möglichen Schlüsselpositionen der bd-II Oxidase wurden die appChisBX-Gene in den pBAD33-Vektor kloniert und der CBO-Stamm, der eine chromosomale Deletion der bd Oxidase-Gene enthält, damit transformiert. Durch ortsgerichtete Mutagenese wurde D239AppC als wichtig für die Bindung des Inhibitors identifiziert. Die beiden E.-coli-bd Oxidasen unterscheiden sich in der Zugänglichkeit der Protonen zum aktiven Zentrum durch einen mutmaßlichen Protonenkanal. In dieser Arbeit wurden die protonierbaren Aminosäuren D58CydB (bd-I) und E58AppB sowie D105AppB (bd-II) in den Protonenkanälen der bd Oxidasen als wichtig für den Protonentransport zum aktiven Zentrum identifiziert. Darüber hinaus wurde untersucht, ob Menachinol, das möglicherweise als alternatives Substrat dient, in dem es die zweite Bindestelle bei Häm b595 nutzt zu einer Steigerung der Aktivität der bd-II Oxidase führt. Statt einer Steigerung wurde entweder kein Effekt oder sogar eine Verringerung der Aktivität mit Ubichinol festgestellt. ND-011992 wurde als potentieller Inhibitor für die bd Oxidase aus M. tuberculosis entdeckt. In dieser Arbeit wurde die Inhibition der Enzyme der E. coli Atmungskette durch ND-011992 untersucht. Überraschenderweise werden sowohl Komplex I als auch die terminalen Oxidasen (bd Oxidasen und bo3 Oxidase) im mikromolaren Bereich gehemmt. Dabei wird Komplex I mit einem IC50 von 0,12 µM am stärksten inhibiert. ND 011992 hemmt somit sowohl Chinonreduktasen als auch Chinoloxidasen. Die Vergleichsmessung mit mitochondrialen Komplex I aus Rinderherz ergab einen deutlich höheren IC50 von 3,27 μM. ND-011992 wurde damit als eine gute Ausgangsverbindung für die Entwicklung eines spezifischen Hemmstoffs für die Enzyme der bakteriellen Atmungskette identifiziert

Abstract: Aerobic respiration is essential for Escherichia coli in the presence of oxygen to produce ATP. E. coli possesses two ubiquinol:oxygen cytochrome bd oxidoreductases (bd-I and bd-II oxidase), which are terminal oxidases of the respiratory chains. These two enzymes reduce molecular oxygen to water and work under (very) low oxygen conditions. For this purpose, the bd oxidases have a high affinity to oxygen. Through a vectorial transport of protons across the membrane coupled to this redox reaction, the bd oxidases contribute to the protonmotive force required for the synthesis of ATP. The family of bd oxidases is found exclusively in prokaryotes and plays an important role for colonizing a host organism in pathogens such as Mycobacterium tuberculosis and Shigella flexneri through its ability to degrade reactive oxygen and nitrogen species. The bd oxidases have therefore become a very promising target for the development of novel antibiotics. As a basis for this, knowledge of the structure and reaction mechanism is necessary. To date, it has also not been clarified why E. coli possesses two different bd oxidases. To contribute to this problem, the structure of the E. coli bd-II oxidase was solved in this work and the differences between the two bd oxidases were investigated by site-directed mutations. To determine the structure of the bd-II oxidase, the genes encoding the bd-II oxidase, appCBX, were cloned into the pET28b(+) vector and a histidine tag was added to the C-terminus of AppC or AppB. The bd-II oxidase was overproduced in the E. coli strain BL21*(DE3) ΔcyoA-D and solubilized from membranes using lauryl maltose neopentyl glycol (LMNG). A preparation was developed to obtain the purest possible form of bd-II oxidase. To solve the structure by cryo-electron microscopy, the detergent LMNG was replaced by the amphipathic detergent Amphipol A8-35. The bd-II oxidase was then measured in collaboration with Dr. Tim Rassmussen and Prof. Dr. Bettina Böttcher at the Rudolf-Virchow-Center of the Julius-Maximilians-University in Würzburg. The structure was solved by Antonia Grauel as part of her master's thesis with a resolution of 3.0 Å. As already suspected by the high sequence identity, the structure of bd-II oxidase shows a high similarity to that of the bd-I oxidase. In contrast to the bd-I oxidase, the bd-II oxidase forms dimers in addition to monomers by a kind of "leucine zipper" in vitro. Furthermore, bd-II oxidase lacks a homolog to the fourth subunit of the bd-I oxidase, resulting in the heme b595 cofactor being accessible from the membrane. However, the formation of a heme d-cyano complex clearly demonstrated that heme d is the active site. Furthermore, the Q-Loop, a structural motif to bind the quinol, of the bd-II oxidase was completely resolved for the first time. This was made possible by an addition of the inhibitor aurachin D. Aurachin D was modelled, providing molecular details of the so far unknown quinol binding site. To investigate possible important positions in bd-II oxidase, the appChisBX genes were cloned into the pBAD33 vector. The E. coli CBO strain containing a chromosomal deletion of the bd oxidase genes was transformed with this vector. D239AppC was identified as important for binding of the inhibitor. The two E. coli bd oxidases differ in the accessibility of protons to the active site through the putative proton channels. In this work, titrable amino acids of the proton channels of the two bd oxidases were investigated by site-directed mutagenesis. D58CydB (bd-I), E58AppB and D105AppB (bd-II) were found to be important for proton transport to the active site. In addition, it was investigated whether menaquinol may act as an alternative substrate that uses the second putative binding site at heme b595. An addition of menaquinol had either no effect on activity or decreased the ubiquinol activity. ND-011992 was found to be a potential inhibitor of bd oxidase from M. tuberculosis. In this work, the inhibitory potential of ND-011992 on E. coli respiratory chain enzymes was investigated. Surprisingly, complex I and the terminal oxidases (bd oxidases and bo3 oxidase) were inhibited in the micromolar range. Complex I was inhibited the most with an IC50 of 0,12 µM. ND 011992 thus inhibits both quinone reductases and quinol oxidases. Measurement with mitochondrial complex I from bovine heart showed a significantly higher IC50 of 3,27 μM. Accordingly, ND-011992 was identified as a good starting compound for the development of a specific inhibitor for bacterial respiratory chain enzymes

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